陳菊移 - 吳玉晗 - 姚 麗 許 宙 吳 倩 陳 偉
(1. 安徽省科學(xué)技術(shù)研究院,安徽 合肥 230088;2. 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230009;3. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院,湖南 長沙 410114)
四環(huán)素類抗生素是一類由放線菌產(chǎn)生的廣譜抗生素[1-3],屬于氧化并四苯環(huán)衍生物。因其價格便宜,抗菌效果好,在畜牧業(yè)中被廣泛作為藥物添加劑使用,用于防治畜禽的腸道感染和促進(jìn)生長[4]。動物的肌肉、肝臟、牛奶等中殘留的四環(huán)素通過食物鏈進(jìn)入人體,造成腎毒、過敏、產(chǎn)生抗生素耐藥性等危害[5-6]。長期食用四環(huán)素殘留超標(biāo)的牛奶更容易誘導(dǎo)體內(nèi)微生物的抗生素耐藥性,造成人體腸道菌群紊亂。因此,中國和歐盟國家規(guī)定牛奶中四環(huán)素類藥物的最大殘留限量為100 μg/L[7-9]。傳統(tǒng)的四環(huán)素檢測方法主要有微生物法、儀器法以及用于快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附法等[10-12]。微生物法是利用四環(huán)素對相關(guān)微生物生長的抑制原理,實現(xiàn)樣品中四環(huán)素的檢測,其操作繁瑣、費(fèi)時;儀器法是目前的國標(biāo)法,能夠?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)定量,但需要復(fù)雜的樣品前處理步驟、昂貴的儀器硬件,以及專業(yè)的操作人員;酶聯(lián)免疫吸附法在一定程度上減少了對儀器的依賴,實現(xiàn)了普通實驗室即可開展四環(huán)素殘留檢測工作,但其相對繁瑣的操作步驟仍無法滿足大批量牛奶樣品的現(xiàn)場快速篩查需求。
膠體金側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)是利用膠體金納米粒子標(biāo)記識別抗體,然后在微孔膜載體上利用液體的毛細(xì)作用對識別產(chǎn)物進(jìn)行層析遷移,在微孔膜上固定抗體或抗原的作用下將金納米粒子聚集在檢測線上,使檢測線顯色。不同濃度的檢測對象其線上顯色強(qiáng)度不同,通過肉眼觀察檢測線上顏色的深淺,即可在現(xiàn)場實現(xiàn)目標(biāo)檢測物的快速篩查和檢測。該方法具有操作簡便、結(jié)果簡單易懂、成本低等優(yōu)勢,作為食品安全快速檢測的重要方法學(xué)之一,在食品安全危害物快速篩查和監(jiān)控方面發(fā)揮重要作用[13-15]。隨著各國在危害物殘留限量方面要求的提高,除大型儀器的檢測方法能滿足較高的檢測要求外[16-18],傳統(tǒng)的膠體金側(cè)向?qū)游龇椒o法滿足某些殘留物不斷提高的檢測限量要求。進(jìn)一步提高傳統(tǒng)膠體金側(cè)向?qū)游鰴z測方法的靈敏度,更好地滿足特定危害殘留物的快速檢測需求,同時可進(jìn)一步拓展膠體金試紙條在痕量超靈敏檢測領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。由于快速的反應(yīng)特點,膠體金側(cè)向?qū)游鲈诿庖叻磻?yīng)方面存在反應(yīng)不充分、效率不高的可能性,從而造成靈敏度低,檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。在液體均相中進(jìn)行快速預(yù)孵育前,進(jìn)行膠體金側(cè)向?qū)游龅拿庖咦R別,再進(jìn)行層析作用,能夠保證免疫識別反應(yīng)的效率,提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。試驗擬將傳統(tǒng)膠體金試紙條直接滴加檢測的反應(yīng)模式,變更為快速預(yù)孵育的模式,旨在提高免疫識別反應(yīng)的效率,提高膠體金試紙條對牛奶中四環(huán)素類殘留物快速檢測的靈敏度,為食品安全抗生素殘留快速檢測提供依據(jù)。
1.1.1 材料與試劑
液體奶:市售;
檸檬酸三鈉、氯金酸:分析純,百靈威化學(xué)試劑有限公司;
酪蛋白鈉(純度>98%)、牛血清白蛋白(純度>98%)、人血清蛋白(純度>99%):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;
硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、吸水紙、PVC支撐底:上海捷寧生物科技有限公司;
羊抗鼠二抗、四環(huán)素單克隆抗體、四環(huán)素人工合成抗原、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(99.8%):北京點石生物科技有限公司。
1.1.2 主要儀器設(shè)備
超純水發(fā)生系統(tǒng):Milli-RO Plus型,美國密理博公司;
加熱磁力攪拌器:RCT型,廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司;
雙噴頭噴膜儀:XYZ3000型,美國Biodot公司;
全自動切條機(jī):CM4000型,美國Biodot公司;
紫外可見分光光度計:UV5100型,安徽皖儀科技股份有限公司;
pH計:pHS-3C型,雷電科學(xué)儀器有限公司。
1.2.1 膠體金納米粒子的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]。
1.2.2 膠體金與四環(huán)素抗體的偶聯(lián) 取500 μL 1.2.1制備的膠體金溶液于1.5 mL離心管,加入一定量的0.1 mol/L K2CO3溶液,調(diào)節(jié)pH;加入一定量的四環(huán)素單克隆抗體,震蕩混勻,旋轉(zhuǎn)反應(yīng)1 h;加入一定量的封閉蛋白,震蕩混勻,旋轉(zhuǎn)混合0.5 h;9 800 r/min離心10 min;去除上清,加入一定量的重懸液,震蕩混勻后備用;將重懸后的溶液分別滴加至微孔板中,4 μL/孔,冷凍干燥后備用。
1.2.3 膠體金試紙條的制備及組裝 將已知濃度羊抗鼠二抗溶液和四環(huán)素包被原溶液分別用PB緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.4)稀釋至1 mg/mL,分別吸入噴膜儀的不同噴頭,在NC膜上劃出兩條線分別作為質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線),于27 ℃烘箱中老化備用。在PVC塑料底板上分別粘貼樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜、吸水墊,利用自動切條機(jī)進(jìn)行分切,得到寬度為5 mm的膠體金試紙條備用。
1.2.4 牛奶樣品中四環(huán)素的檢測 通過液相色譜—質(zhì)譜鑒定為四環(huán)素類陰性后,向其中添加一定濃度的四環(huán)素,得到不同四環(huán)素添加濃度的牛奶樣品。分別取80 μL不同濃度的牛奶樣品,加入至冷凍干燥的膠體金—抗體復(fù)合物的微孔中進(jìn)行預(yù)孵育。室溫下預(yù)孵育反應(yīng)10 min后,直接將膠體金試紙條樣品墊一端插入微孔板中,或者將微孔板中的混合溶液滴加于膠體金試紙條的樣品墊上,5 min后觀察試紙條上C線和T線的出線情況,判讀結(jié)果。將判讀后的試紙條結(jié)果,通過專業(yè)灰度分析軟件ImageJ對C線和T線的顯色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析,實現(xiàn)對牛奶中四環(huán)素殘留的快速定量分析。
2.1.1 抗體修飾量 膠體金納米粒子表面固定標(biāo)記的抗體的量直接影響金納米粒子的穩(wěn)定性和試紙條檢測的靈敏度。由圖1可知,當(dāng)抗體修飾量從1 μL增加至3 μL時,T線的顯色強(qiáng)度有所增加;繼續(xù)增加至5 μL時,T線的顯色強(qiáng)度無明顯增加。因此選擇3 μL作為增強(qiáng)型膠體金試紙條的抗體修飾量。
圖1 抗體修飾量對預(yù)孵育增強(qiáng)型膠體金試紙條標(biāo)記的影響
2.1.2 K2CO3用量 膠體金與抗體的偶聯(lián)是基于表面電荷吸附進(jìn)行抗體固定的。由圖2可知,當(dāng)在膠體金溶液中加入3 μL K2CO3調(diào)節(jié)pH后,隨著牛奶中目標(biāo)四環(huán)素濃度的增加,T線競爭抑制的效果不明顯,至2 μg/L仍有明顯的顯色,靈敏度不夠;隨著膠體金中K2CO3溶液添加量的增加,相同四環(huán)素濃度下,競爭抑制消線效果越來越明顯,當(dāng)膠體金體系中加入7 μL K2CO3溶液后,體系中0.5 μg/L的四環(huán)素就能引起T線的完全消線。但與5 μL K2CO3溶液調(diào)節(jié)后的檢測結(jié)果相比,T線的顯色變淺??紤]到肉眼判斷的敏感性,選擇在膠體金體系中加入5 μL K2CO3溶液作為最佳pH調(diào)節(jié)條件。
2.1.3 偶聯(lián)物復(fù)溶體積 將識別抗體與膠體金偶聯(lián)后,分散體系的大小決定偶聯(lián)物濃度高低,直接影響所制備預(yù)孵育增強(qiáng)型膠體金試紙條的檢測結(jié)果。由圖3可知,隨著膠體金偶聯(lián)物復(fù)溶體積的增加,C/T線顯色強(qiáng)度逐漸減弱,但靈敏度卻沒有顯著提高。與50 μL復(fù)溶體積相比,60,70 μL復(fù)溶體積的C/T線在0.5 μg/L時已基本消線。陰性條件下,T線顯線強(qiáng)度不高,達(dá)不到檢測要求。50 μL復(fù)溶體積條件下,1 μg/L基本消線,同時陰性T線強(qiáng)度高,對比明顯。因此,選擇50 μL作為膠體金偶聯(lián)物最佳復(fù)溶體積。
圖3 偶聯(lián)物復(fù)溶體積對預(yù)孵育增強(qiáng)型膠體金試紙條標(biāo)記的影響
由圖4可知,經(jīng)預(yù)孵育后上樣的膠體金試紙條在0~2 μg/L,競爭免疫識別模式下,試紙條上T線的顯色強(qiáng)度隨目標(biāo)四環(huán)素濃度的增加越來越弱,當(dāng)四環(huán)素濃度為1 μg/L 時,T線的強(qiáng)度與陰性結(jié)果相比有明顯的減弱,可作為預(yù)孵育膠體金試紙條檢測四環(huán)素的靈敏度;當(dāng)檢測樣品中四環(huán)素濃度增加至2 μg/L時,T線被完全抑制不顯色,作為預(yù)孵育膠體金試紙條檢測四環(huán)素的消線濃度。由圖5可知,傳統(tǒng)膠體金試紙條在檢測樣品中四環(huán)素濃度為5 μg/L時,T線相比于陰性檢測發(fā)生明顯的減弱,當(dāng)四環(huán)素濃度進(jìn)一步增加至10 μg/L時,T線完全被抑制。綜上,通過對待測樣品與膠體金進(jìn)行預(yù)孵育后,再利用膠體金試紙條進(jìn)行檢測,其靈敏度和檢測線均有顯著提高和改善,利用膠體金預(yù)孵育后,四環(huán)素的檢測靈敏度提高了5倍,有利于低濃度條件下牛奶中四環(huán)素的準(zhǔn)確檢測。
圖5 傳統(tǒng)膠體金試紙條的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果
由圖6可知,隨著牛奶中四環(huán)素濃度的增加,試紙條檢測T線的顯色越來越弱。當(dāng)牛奶中四環(huán)素濃度為0.5 μg/L時,膠體金試紙條上T線顯色已明顯降低;當(dāng)牛奶中四環(huán)素濃度進(jìn)一步增加至2 μg/L后,膠體金試紙條上T線被完全抑制不顯色。說明預(yù)孵育增強(qiáng)型膠體金試紙條能夠在無需復(fù)雜樣品前處理的條件下,直接利用牛奶上樣,預(yù)孵育處理樣品后,利用膠體金試紙條進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測。與圖4相比,牛奶中復(fù)雜的樣品基質(zhì)對目標(biāo)四環(huán)素的檢測沒有明顯的影響,具有較強(qiáng)的抗基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)四環(huán)素濃度為0.05~2.00 μg/L時,檢測信號具有很好的線性響應(yīng)(R2=0.987 3),可以基于此規(guī)律實現(xiàn)牛奶中四環(huán)素殘留物的快速半定量分析。
圖6 預(yù)孵育增強(qiáng)型膠體金試紙條的牛奶中四環(huán)素檢測結(jié)果
對傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測牛奶中四環(huán)素殘留的反應(yīng)模式進(jìn)行了改進(jìn),將直接加樣的反應(yīng)模式改為預(yù)孵育反應(yīng)模式,對牛奶中四環(huán)素殘留檢測的靈敏度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,牛奶樣品中四環(huán)素殘留檢測限提高了5倍,達(dá)1 μg/L,說明進(jìn)一步提高膠體金側(cè)向?qū)游鰴z測中免疫識別反應(yīng)的效率對側(cè)向?qū)游龇椒▽W(xué)檢測靈敏度的提高具有重要意義。后續(xù)擬采用微流控芯片封裝試紙條的預(yù)孵育模式,從而進(jìn)一步簡化檢測步驟和提高方法學(xué)的操作性。