油菜FBA基因克隆、表達(dá)分析及其與抗旱性的關(guān)系

謝小玉,何巧麗,侯 爽,張小短,馬仲煉

西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715

季節(jié)性干旱是油菜生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一,尤其春旱使我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)的油菜平均減產(chǎn)20%以上[1]。研究表明,干旱脅迫下油菜的凈光合速率(the net photosynthetic rate,Pn)降低[2],隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),下降幅度不斷增加,下降幅度與油菜抗旱性有關(guān)[3]。油菜產(chǎn)量與蕾苔期葉片凈光合速率抗旱系數(shù)呈極顯著正相關(guān)[4]。要提高油菜的抗旱性,就需提高干旱脅迫下油菜的光合效率。果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)既參與了糖酵解和糖異生過(guò)程,同時(shí)又參與了磷酸戊糖途徑和卡爾文循環(huán)[5-6],對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。對(duì)油菜的研究發(fā)現(xiàn)FBA基因參與干旱脅迫應(yīng)答。通過(guò)對(duì)FBA基因的克隆、表達(dá)分析及干旱脅迫下基因表達(dá)量與凈光合速率、產(chǎn)量等之間的關(guān)系分析,對(duì)于揭示FBA基因在油菜抗旱中的作用及對(duì)油菜抗旱性鑒定和抗旱性改良具有重要意義。

前人研究表明,在自然界中存在兩類FBA,有不依賴金屬離子的第Ⅰ類酶和依賴金屬離子的第Ⅱ類酶[7]。高等植物中的FBA均為I型,又存在2種亞型,即胞質(zhì)型FBA和質(zhì)體型FBA[8]。前者存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,參與糖酵解和糖異生途徑,催化果糖- 1,6-二磷酸的裂解[9-10];后者分布于葉綠體中,參與卡爾文循環(huán)中1,5-二磷酸核酮糖的再生[11-12]。近幾年研究表明,植物的果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶不僅參與了很多的生理和生化過(guò)程[13- 15],還參與了植物對(duì)高溫[16]、低溫[8]、干旱[17]、鹽[10,18]、鎘[19]、硼[20]等多種脅迫的響應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。Lu 等[8]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下擬南芥的FBA基因家族成員中的AtFBA3、AtFBA4、AtFBA6 和AtFBA8 表達(dá)量均上調(diào);Fan 等[10]研究表明海馬齒的FBA基因在鹽脅迫后強(qiáng)烈表達(dá),超表達(dá)后可以明顯提高植株的耐鹽性;胡楊細(xì)胞質(zhì)中的果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶通過(guò)促進(jìn)糖酵解和有氧呼吸途徑提高植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性[21]。Larkindale等[22]研究表明37℃的高溫顯著誘導(dǎo)擬南芥AtFBA6基因的大量積累。孫勝楠等[23]研究表明,FBA活性與基因表達(dá)均受高溫誘導(dǎo),誘導(dǎo)效應(yīng)與溫度升高幅度和高溫持續(xù)時(shí)間有關(guān)。通過(guò)表型分析及基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在擬南芥低溫致死的突變體中,FBA基因的表達(dá)量發(fā)生了明顯的上調(diào)[24]。干旱脅迫下,擬南芥的AtFBA1,6,8表達(dá)量上調(diào)8倍以上[25];陳娜[26]等的研究也表明,FBA基因可能參與花生對(duì)高鹽和干旱脅迫的適應(yīng)性調(diào)控。目前研究者們已克隆出了紫花苜蓿[27]、番茄[16]等多種植物的FBA基因序列,Uematsu等[12]通過(guò)將擬南芥的質(zhì)體FBA基因在煙草中進(jìn)行異源表達(dá),使轉(zhuǎn)基因煙草的光合速率增加,促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)和生物量的積累。但至今未見關(guān)于油菜FBA基因研究的報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)前期構(gòu)建的基于干旱脅迫下甘藍(lán)型油菜 SSH文庫(kù)[28]的測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)FBA基因參與干旱脅迫應(yīng)答。在此基礎(chǔ)上,采用RACE方法對(duì)基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定FBA基因表達(dá)量,分析表達(dá)量與干旱脅迫下油菜光合指標(biāo)、酶活性、產(chǎn)量等之間的關(guān)系,明確FBA基因與油菜抗旱性的關(guān)系,為油菜FBA基因功能研究以及利用FBA基因改良作物抗旱性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試驗(yàn)處理

供試材料為經(jīng)鑒定抗旱能力強(qiáng)的甘藍(lán)型油菜94005(由重慶市油菜工程研究中心提供)。挑選籽粒飽滿、大小均一的油菜種子,用15%的次氯酸鈉消毒20 min,然后用無(wú)菌水清洗5次,播種于室內(nèi)以蛭石和草炭(1∶1)為基質(zhì)的塑料營(yíng)養(yǎng)缽中,在室溫下培養(yǎng)至幼苗四葉一心時(shí)將其移栽到遮雨人工網(wǎng)室內(nèi)的盆缽中(盆高40 cm,直徑30 cm,盆中所用基質(zhì)為草炭土、自然土壤和蛭石按1∶3:1比例混合而成的混合物,基質(zhì)提前用多菌靈和敵百蟲殺菌滅蟲,每盆裝基質(zhì)15.0 kg,使其達(dá)9成滿,施氮磷鉀復(fù)合肥30 g),每盆定植2 株,期間進(jìn)行正常的田間管理。

油菜生長(zhǎng)至初花期,選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且生長(zhǎng)一致的植株進(jìn)行干旱處理,分為5組：正常供水(control, CK)、輕度干旱(lightly drought, LD)、中度干旱(moderate drought, MD)、重度干旱(severe drought, SD)和極度干旱(extreme drought, ED),其土壤相對(duì)含水量分別為65%—75%、50%—55%、40%—45%、20%—30%、10%—15%。每個(gè)處理種植8盆,共16株。自然干旱至設(shè)定土壤相對(duì)含水量標(biāo)準(zhǔn)范圍,每天8:00和18:00采用稱重法補(bǔ)水控水,處理期間除盆內(nèi)土壤含水量差異外其他管理一致,土壤相對(duì)含水量達(dá)到干旱脅迫條件時(shí)持續(xù)7d取樣測(cè)定,之后復(fù)水使土壤含水量恢復(fù)到對(duì)照水平,并正常水分管理培養(yǎng)至成熟期測(cè)定產(chǎn)量。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1抑制消減雜交(Suppression subtractive hybridization, SSH)文庫(kù)構(gòu)建

對(duì)干旱脅迫的植株分別在第1天、第3天、第5天和第7天 9:00—9:30 采集對(duì)照和處理頂部完全展開的第1葉混合,液氮速凍,-80℃保存。進(jìn)行RNA的提取及mRNA的純化,抑制性消減雜交,SSH-cDNA文庫(kù)構(gòu)建以及差異表達(dá)序列測(cè)序和生物信息學(xué)分析[30]。

1.2.2光合參數(shù)的測(cè)定

用美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn)的LI- 6400光合儀,在干旱脅迫的第7天(晴天)10：00點(diǎn)左右,對(duì)對(duì)照和處理植株的頂部外部向陽(yáng)完全展開的長(zhǎng)勢(shì)一致的第2—3片葉測(cè)定凈光合速率(Net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導(dǎo)度(Stomatal conductance,Gs)、胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration,Ci)、蒸騰速率(Transpiration rate,Tr),采用LI- 6400-02B紅藍(lán)光光源,設(shè)定光強(qiáng)為1600 μmol m-2s-1,溫度為25℃,大氣CO2濃度(Ca)為400 μmol/mol,空氣相對(duì)濕度為50%—70%;計(jì)算水分利用率(Water use efficiency, WUE),水分利用率(WUE)=光合速率(Pn)/蒸騰速率(Tr)。采用輪回測(cè)定的方法,每個(gè)處理測(cè)定3株。

1.2.3FBA酶活性的測(cè)定

剪取測(cè)定完光合參數(shù)的葉片,-20℃保存,采用上海優(yōu)選生物科技有限公司的植物果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶試劑盒(微量法)測(cè)定FBA的活性,所有操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4FBA基因表達(dá)量的測(cè)定

剪取測(cè)定完光合參數(shù)的葉片,液氮速凍,-80℃保存,采用天根公司的RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒提取總RNA,利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的完整性,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度。使用TAKARA公司的PrimerScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行RNA的純化和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 根據(jù)SSH文庫(kù)中FBA基因的 EST(表達(dá)序列標(biāo)簽,Expressed sequence tag) 序列,利用Vector NTI軟件和primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,正向引物為5′-TACCTGGCATCAAAGTCGACAA- 3′,反向引物5′-TCG TAGTACTTCTTGCAACGCT- 3′。以ACT7和UBC12為候選內(nèi)參基因,通過(guò)基因表達(dá)穩(wěn)定性的分析[29],以ACT7為內(nèi)參基因,正向引物TGGGTTTGCTGGTGACGAT,反向引物TGCCTAGGACGACCAACA ATACT。使用BIO-RAD公司的iTaq TM Universal SYBR? Green Supermix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?5℃ 3min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,45個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù),采用2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)量[30]。

1.2.5FBA基因的全長(zhǎng)克隆

采用Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得基因的3′端序列。以RACE-Ready c DNA為模板,在試劑盒提供的通用引物UPM及基因特異性引物GSP引導(dǎo)下,用Advantage 2 Polymerase Mix催化合成相關(guān)基因的cDNA末端。引物序列為：FBA- 1: AGGAAGGAGGAGTCTTACCT GGCATCA、FBA- 2: TCGACAAGGGCACCGTTTCTCTACC,第一輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件：94℃ 3 min;94℃ 30 sec,68℃ 30 sec,72℃ 3 min,25循環(huán);72℃ 10 min;再進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件：94℃ 3 min;94℃ 30 sec,68℃ 30 sec,72℃ 3 min,25循環(huán);72℃ 10 min;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,按TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行凝膠回收,回收純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

1.2.6測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

采用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)上的 BLAST 工具對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行基因序列的相似性及同源性查找,并利用這些序列進(jìn)行基因同源性的比較,用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 在線分析全長(zhǎng)序列的開放閱讀框(Open reading frame, ORF),利用 DNAMAN 軟件將基因的 ORF序列翻譯成氨基酸,利用Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì),利用 PSORT II Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);采用PredictProtein (http://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),運(yùn)用 SWISS-MODEL對(duì)氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,用Raswin 視圖軟件得到該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。用Vector NTI Advance11.5程序進(jìn)行序列比對(duì)分析,用MEGA5.2.2軟件構(gòu)建進(jìn)化樹,在SOPMA和SWISS MODEL網(wǎng)站上進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSH分析發(fā)現(xiàn)FBA基因與抗旱有關(guān)

通過(guò)對(duì)干旱誘導(dǎo)的SSH文庫(kù)中646個(gè)經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性克隆測(cè)序,獲得639個(gè)單一的EST,經(jīng)過(guò)聚類、拼接和去除冗余,獲得重疊群(contigs)89條,單拷貝序列 (singleton)97條。對(duì)測(cè)序獲得的186條unigene進(jìn)行Blastn和Blastx數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)其中166條具有同源基因,20條沒有匹配項(xiàng)。具有同源基因的EST中154條與已知功能的蛋白有同源性,其中果糖- 1, 6-二磷酸醛縮酶基因11條,占具有同源性基因的6.63%。表1列出了部分ESTs。

2.2 FBA基因的克隆與序列分析2.2.1 FBA基因的RACE克隆

在已獲得的保守區(qū)基礎(chǔ)上,以3′RACE的cDNA為模板,經(jīng)2輪PCR之后擴(kuò)增出大小約900bp的單一DNA片段。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提交Genebank,命名為BnFBA1,基因登錄號(hào)為 MH316131。經(jīng)過(guò)軟件分析,確認(rèn)此片段大小為975 bp,與保守區(qū)序列有368 bp的重疊片段,是油菜FBA的mRNA3′端序列。

2.2.2FBA基因的序列分析

(1) 油菜BnFBA1基因編碼產(chǎn)物的基本性質(zhì)分析

用DNAMAN V6將測(cè)序結(jié)果與已知FBA序列進(jìn)行拼接,得到FBA全長(zhǎng)序列1440bp,預(yù)測(cè)基因的ORF位于60—1170區(qū)域(共1107bp),編碼369個(gè)氨基酸。

經(jīng)ProtParam分析,FBA蛋白序列分子量為38.51 KDa,等電點(diǎn)6.92,酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為70個(gè),堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為47個(gè),原子總數(shù)為5445,分子式為C1705H2738N466O526S10,半衰期為30h,穩(wěn)定系數(shù)29.51,是穩(wěn)定蛋白。 較高含量的氨基酸有Ala(丙氨酸,10.6%),Leu(亮氨酸,10.1%),不含Pyl(苯丙氨酸)和Sec(絲氨酸)。亞細(xì)胞定位分析表明該蛋白是細(xì)胞質(zhì)蛋白。

表1 油菜葉片干旱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的部分基因

(2) 油菜BnFBA1蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

BnFBA1基因編碼的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖1)表明,該基因編碼的氨基酸序列由43.85%的α螺旋(alpha helix) 、31.28%的無(wú)規(guī)卷曲(random coil) 、17.60% 的延伸鏈(extended strand)、7.26%的β轉(zhuǎn)角(beta turn)構(gòu)成。

圖1 BnFBA1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 The predicted secondary structure of BnFBA1 protein藍(lán)色:α螺旋; 紫色:無(wú)規(guī)則卷曲; 紅色:延伸鏈; 綠色:β轉(zhuǎn)角

BnFBA1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖2)模型中清晰地看到α螺旋和β片層結(jié)構(gòu),與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

圖2 BnFBA1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型Fig.2 Predicted 3-D dimensional structure of BnFBA1 protein

(3) 不同物種間BnFBA1基因編碼蛋白質(zhì)同源性分析

多重序列比對(duì)分析顯示甘藍(lán)型油菜94005的BnFBA1與擬南芥、花生、野生大豆、苜蓿等7種植物的細(xì)胞質(zhì)FBA有69.8%的總體同源性(圖3);從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)可看出,甘藍(lán)型油菜94005的細(xì)胞質(zhì)FBA與擬南芥的細(xì)胞質(zhì)FBA同源性最高。

2.3 FBA的表達(dá)分析及其與抗旱性關(guān)系2.3.1 干旱對(duì)油菜葉片F(xiàn)BA表達(dá)量的影響

所有提取的葉片總RNA通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的結(jié)果表明18S與28S條帶清晰、明亮,28S條帶比18S條帶更亮,兩者之比大于1。經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè),提取的總RNA的OD260/OD280值均在2.0—2.2之間,表明提取的總RNA完整、質(zhì)量高、純度好,達(dá)到了反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR的要求(圖5)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果(表2)表明,在干旱脅迫下,FBA基因的表達(dá)量隨著干旱脅迫程度的增加而增加,其中輕度、中度、重度和極度干旱下上升幅度分別為1.73%,3.97%,6.48%,7.23%。

2.3.2FBA的表達(dá)與抗旱性的關(guān)系

(1)干旱脅迫下油菜產(chǎn)量、光合特性及FBA活性的變化

表3表明,隨著干旱脅迫的加劇,油菜產(chǎn)量、葉片Pn、Gs以及Tr下降幅度加大。在輕度、中度、重度和極度干旱脅迫下,產(chǎn)量分別較對(duì)照降低40.78%、45.55%、53.69%、62.90%,Pn分別較對(duì)照降低17.96%、45.42%、65.43%、82.71%,Gs分別較對(duì)照降低34.02%、65.98%、83.50%、84.87%,Tr分別較對(duì)照降低26.55%、47.57%、78.13%、80.54%。

表2 干旱脅迫下BnFBA1基因的表達(dá)情況

FBA活性隨著干旱脅迫的增加而增加,輕度、中度、重度和極度干旱脅迫下,分別比對(duì)照高18.45%、31.69%、32.35%、35.66%。而Ci隨著干旱脅迫的加劇降低,到重度干旱下達(dá)到最低,而極度干旱下又上升; WUE隨著干旱脅迫的加劇不斷上升,到重度干旱脅迫下達(dá)到最大,極度干旱脅迫下又下降。

表3 干旱脅迫對(duì)油菜產(chǎn)量、光合特性及FBA活性的影響

圖4 油菜BnFBA1的系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.4 Phylogenetic relationship of amino acid sequences between BnFBA1 and other species

圖5 總RNA電泳圖Fig.5 Electrophoresis profile of total RNA M代表標(biāo)記,1/2/3/4/5代表CK/LD/MD/SD/ED/,6/7/8/9/10為重復(fù);CK:正常供水Control; LD:輕度干旱Llightly drought; MD:中度干旱Mmoderate drought; SD:重度干旱Severe drought; ED:極度干旱Extreme drought

(2)干旱脅迫下FBA基因表達(dá)量、酶活性和油菜產(chǎn)量等指標(biāo)的關(guān)系

用SPSS 17.0軟件分析干旱脅迫處理下油菜FBA基因的表達(dá)量與酶活性、產(chǎn)量、光合參數(shù)的相關(guān)性(表4)表明,FBA表達(dá)量與FBA活性呈顯著正相關(guān),與Pn、Gs、Tr呈極顯著負(fù)相關(guān),與產(chǎn)量呈顯著負(fù)相關(guān)。FBA活性與干旱脅迫下Pn呈顯著負(fù)相關(guān),與產(chǎn)量、Gs、Tr呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

3.1 FBA基因與油菜抗旱性密切相關(guān)

FBA作為一類重要的糖代謝酶,處于6C糖可逆地轉(zhuǎn)化為3C糖的關(guān)鍵部位,越來(lái)越多的證據(jù)表明這一家族在許多代謝和發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的作用[31]。近年來(lái),FBA相繼在擬南芥[8]、番茄[16]、黃瓜[31]等不同的物種中展開了研究,發(fā)現(xiàn)FBA基因除了受光照、溫度、鹽等非生物因素的脅迫外,還參與了植物的干旱調(diào)控[8,17]。本研究從干旱脅迫下的SSH文庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)FBA參與油菜對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答;干旱脅迫下,油菜BnFBA1基因表達(dá)量和酶活性增加,這與擬南芥的研究結(jié)果相同[25]。這說(shuō)明FBA是干旱脅迫響應(yīng)基因。

干旱脅迫導(dǎo)致油菜葉片Gs、Tr、Pn和產(chǎn)量下降;在輕度(Lightly drought, LD)、中度(Moderate drought, MD)和重度(Severe drought, SD)脅迫下,Ci下降、WUE提高,而在極度干旱(Extreme drought, ED)下,Ci上升、WUE下降,可能是由于干旱脅迫下果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶參與糖酵解,分解葡萄糖,使細(xì)胞內(nèi)糖分降低,水勢(shì)升高,氣孔關(guān)閉;而在極度干旱(ED)下由于氣孔關(guān)閉時(shí)間較長(zhǎng),Ci升高,細(xì)胞內(nèi)pH值降低,水勢(shì)降低,WUE下降,Pn下降,果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶參與糖酵解并合成甘油來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓以提高油菜抗旱性。

表4 油菜產(chǎn)量、基因表達(dá)量、酶活性、凈光合速率的相關(guān)性

3.2 克隆的油菜BnFBA1基因?qū)儆诎|(zhì)型FBA

干旱處理小麥7d后,包括果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶在內(nèi)的一系列參與卡爾文循環(huán)的酶基因表達(dá)協(xié)同下調(diào)[32]。而本研究表明,干旱脅迫下BnFBA1基因表達(dá)上調(diào),FBA基因表達(dá)量、FBA酶活性與油菜葉片Pn、產(chǎn)量呈顯著負(fù)相關(guān)。對(duì)成功克隆的BnFBA1同源的氨基酸序列對(duì)比顯示甘藍(lán)型油菜94005的FBA與擬南芥、花生、大豆、苜蓿等7種植物的細(xì)胞質(zhì)FBA有69.8%的總體同源性;與擬南芥的細(xì)胞質(zhì)FBA同源性最高。這表明FBA在進(jìn)化過(guò)程中保證了足夠的遺傳穩(wěn)定性,克隆的BnFBA1基因?qū)儆诎|(zhì)型FBA,這與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

3.3 需進(jìn)一步研究的問題

前人研究表明,FBA基因一方面改變植物糖類物質(zhì)的代謝,另一方面可調(diào)節(jié)植物的生殖生長(zhǎng)[25],本研究中干旱脅迫下油菜產(chǎn)量降低是否是由于FBA促進(jìn)生殖生長(zhǎng)提前而導(dǎo)致產(chǎn)量下降,還需進(jìn)一步研究。同時(shí),后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)掘更多的FBA基因,進(jìn)一步分析蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)與抗旱性的關(guān)系,深入研究胞質(zhì)型FBA調(diào)控糖代謝和生殖生長(zhǎng)的過(guò)程及該基因家族在油菜干旱脅迫下的調(diào)節(jié)機(jī)制。

4 結(jié)論

從油菜中成功克隆獲得1條FBA基因,該基因與油菜抗旱性密切相關(guān),屬于胞質(zhì)型FBA。