基于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)研究白術(shù)揮發(fā)油的主要成分作用靶點(diǎn)及藥效預(yù)測(cè)

于啟蒙，張新超，孟慧琴，張 霖，朱德志，章 偉，王愛東

（黃山學(xué)院，黃山 2544041）

1 前言

白術(shù)（Rhizoma atractylodis macrocephalae）為菊科植物，根狀莖為拳頭大小且形似如意，表面有瘤狀突起和根須，干燥根莖為表面灰黃或灰棕色的不規(guī)則的肥厚團(tuán)塊[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中最先載錄白術(shù)：“術(shù)，味苦溫。主風(fēng)寒濕痹，死肌，痙，痘，止汗，除熱，消食，作煎餌，久服，輕身延年，不饑。一名山薊。生山谷?！盵2]。白術(shù)具有潛在的抗多種腫瘤、抗SARSCoV、抗炎殺菌、抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病，治療糖尿病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病的藥效作用[3-6]。在2019年底爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19，SARS-CoV-2）藥物治療方案中，官方共納入18種中藥方劑供新冠肺炎的預(yù)防和治療，其中白術(shù)多次被用到[7]。白術(shù)主要含有揮發(fā)油類成分，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[8]，蒼術(shù)酮、β-欖香烯、香橙烯和異香橙烯[9]是揮發(fā)油的主要成分，也是白術(shù)的主要活性成分。

本文使用DS 軟件中的反向找靶功能模塊尋找由白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮、β-欖香烯、香橙烯和異香橙烯組成的配體分子庫(kù)的潛在作用靶點(diǎn)蛋白；然后利用DS 軟件中的分子對(duì)接功能模塊查看分子庫(kù)中7個(gè)分子與契合值（Fit value）≥0.9，且對(duì)應(yīng)打分最高的靶點(diǎn)蛋白的非鍵相互作用情況，并預(yù)測(cè)各分子的藥效機(jī)理，為中藥白術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究、疾病治療和新藥研發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 配體分子庫(kù)準(zhǔn)備

利用軟件BIOVIA Draw 2016 構(gòu)建白術(shù)揮發(fā)油的主要成分2D 平面結(jié)構(gòu)：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（Butenolide Ⅰ）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（Butenolide Ⅱ）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（Butenolide Ⅲ）、蒼術(shù) 酮（Atractylone）、β- 欖香烯（β-Elemene）、 香橙 烯（Aromadendrene）和異香橙烯（Allo-aromadendrene），結(jié)構(gòu)式如圖1為所示。將其保存為mol 文件，然后導(dǎo)入到DS 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件中呈現(xiàn)為3D 空間構(gòu)象；最后進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化，保存為dsv 文件。

2.2 反向找靶計(jì)算

用DS 打開優(yōu)化后的分子庫(kù)文件，打開Ligand profiler 參數(shù)瀏覽器，設(shè)置參數(shù)：①輸入配體；②展開藥效團(tuán)輸入欄，在是/否添加形狀束縛的搜索限制中選擇“All”，在是/否進(jìn)行全庫(kù)搜索中選擇“All Models”；③展開高級(jí)設(shè)置組，設(shè)置Save Aligned Ligands 為True；④在是/否進(jìn)行平行運(yùn)算中選擇“True”；⑤其余保持默認(rèn)，點(diǎn)擊“Run”運(yùn)行。

圖1 白術(shù)揮發(fā)油的主要成分分子結(jié)構(gòu)式

2.3 分子對(duì)接計(jì)算

2.3.1 靶點(diǎn)蛋白準(zhǔn)備

根據(jù)表1 中的PDB ID 從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蛋白質(zhì)文件。利用DS 對(duì)蛋白質(zhì)預(yù)處理，刪除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的水分子、雜原子和自身結(jié)構(gòu)解析時(shí)所攜帶的金屬離子或溶劑殘留分子；最后對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化后保存為dsv文件。

表1 配體分子和靶點(diǎn)蛋白信息表

2.3.2 分子對(duì)接操作

本 文 采 用Discovery Studio 2016 軟 件CDOCKER 中 的Dock Ligands（Pharmacophore Restraints and CHARMm）進(jìn)行對(duì)接運(yùn)算。打開對(duì)接參數(shù)瀏覽器設(shè)置參數(shù)：①輸入受體蛋白；②輸入配體分子；③輸入藥效團(tuán)；④在是/否進(jìn)行平行運(yùn)算中選擇“True”；⑤其余保持默認(rèn)，點(diǎn)擊“Run”運(yùn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 反向找靶結(jié)果

（1）反向找靶運(yùn)行完成后，打開結(jié)果報(bào)道頁(yè)面，點(diǎn)擊Fits Organized by Molecule 鏈接，查看配體分子與靶標(biāo)藥效團(tuán)的契合值（Fit value），篩選出與靶標(biāo)藥效團(tuán)的Fit value ≥0.9的配體分子和各配體分子對(duì)應(yīng)打分最高的靶點(diǎn)蛋白（見表1）。

（2）篩選出與配體分子的Fit value ≥0.8 的靶標(biāo)藥效團(tuán)，利用生物信息分析熱圖聚類分析軟件HemI 1.0做配體分子與對(duì)應(yīng)的各靶標(biāo)藥效團(tuán)的Fit value 值的熱圖。橫坐標(biāo)為各靶標(biāo)藥效團(tuán)模型，縱坐標(biāo)為配體分子；圖中右側(cè)的標(biāo)尺顏色為漸變色，從藍(lán)色至紅色逐漸過渡，表示Fit value 值從“0.800”逐級(jí)遞增。Fit value 值越大，表示小分子與靶標(biāo)蛋白契合得越好，說明對(duì)應(yīng)的蛋白是小分子潛在作用的靶點(diǎn)的可能性高。熱圖結(jié)果如圖2所示。

圖2 配體分子與靶標(biāo)藥效團(tuán)契合值（Fit value）的熱圖

3.2 分子對(duì)接結(jié)果和藥效預(yù)測(cè)

分子對(duì)接計(jì)算運(yùn)行完成后，通過DS 的Receptor-Ligand Interactions 模塊查看配體分子與受體殘基的非鍵相互作用情況，結(jié)合National Center for Biotechnology Information（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白的信息介紹預(yù)測(cè)配體分子進(jìn)行藥效。

（1）2OXX 是 蛋 白 激 酶—酪 蛋 白 激 酶2 或II（casein kinase，CK2）。CK2是高度多效性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在特定情況下能夠促進(jìn)細(xì)胞存活并增強(qiáng)腫瘤表型[10]。CK2調(diào)控許多細(xì)胞功能，目前它是研究癌癥的目標(biāo)。圖3～圖4分別為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與2OXX 相互作用圖。

圖3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ與2OXX相互作用圖（上左3D前，上右3D后，下2D）

圖4 白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與2OXX相互作用圖（上左3D前，上右3D后，下2D）

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ與2OXX 通過氫鍵、烴基和π-烷基鍵相互作用；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與2OXX 通過π-硫鍵、烴基和π-烷基鍵相互作用；預(yù)測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ分子與CK2結(jié)合相互作用，能夠抑制其活性，具有潛在的抗癌藥效作用。

（2）3LBJ 是MDMX 蛋白（murine double minute X，又稱為MDM4）。MdmX 過表達(dá)通過抑制腫瘤抑制因子p53促進(jìn)癌癥的發(fā)展，抑制因子p53在細(xì)胞周期阻滯、DNA 損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等生物過程發(fā)揮重要作用，并成為腫瘤治療靶點(diǎn)[11]。圖5為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與3LBJ 相互作用圖。

圖5 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與3LBJ相互作用圖（左3D，右2D）

白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與3LBJ通過氫鍵、烴基和π-烷基鍵相互作用；預(yù)測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ分子可成為MDMX 蛋白的抑制劑，為治療惡性腫瘤帶來新方向。

（3）3A51是維生素D3羥化酶（Vitamin D3hydroxylase，Vdh）。Vdh 是一種細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶，能催化維生素D3（VD3）特定位點(diǎn)羥基化反應(yīng)，產(chǎn)生活性衍生物[12]。VD3調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的增值、分化或功能，與腫瘤發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)、抗炎效應(yīng)等相關(guān)[13]。圖6為蒼術(shù)酮與3A51相互作用圖。

圖6 蒼術(shù)酮與3A51相互作用圖（左3D，右2D）

蒼術(shù)酮與3A51通過烴基和π-烷基鍵相互作用；預(yù)測(cè)蒼術(shù)酮分子可增強(qiáng)維生素D3羥化酶活性，有潛在的抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)藥效。

（4）1P5E 是細(xì)胞周期蛋白A（Cyclin A）和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2（cyclin-dependent protein kinase2，CDK2）的復(fù)合物（Cyclin A-CDK2）。Cyclin A-CDK2活性異常上調(diào)是腫瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)特征，在一些癌細(xì)胞中，頻繁檢測(cè)到極度活躍的Cyclin A-CDK2活性，Cyclin A-CDK2已經(jīng)成為治療癌癥的重要靶標(biāo)[14]。圖7為β-欖香烯與1P5E 相互作用圖。

圖7 β-欖香烯與1P5E相互作用圖（左3D，右2D）

β-欖香烯與1P5E通過烴基和π-烷基鍵相互作用；預(yù)測(cè)β-欖香烯分子可以作用于活性異常的Cyclin A-CDK2，成為研究抗癌的新藥物。

（5）2WU7 是雙特異性蛋白激酶（dual specificity protein kinase，DSK）家族的CDC 樣激酶3（cell division cycle like kinase 3，CLK3），CLK 激酶是蛋白質(zhì)剪接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化剪接因子上的富含絲氨酸和精氨酸（SR）的結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的剪接[15]。DSK 可能與細(xì)胞癌變、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞生長(zhǎng)等有關(guān)[16]。圖8為香橙烯與2WU7相互作用圖。

圖8 香橙烯與2WU7相互作用圖（上左3D前，上右3D后，下2D）

香橙烯與2WU7通過烴基和π-烷基鍵相互作用；預(yù)測(cè)異香橙烯分子與CLK3相互作用，可開發(fā)為靶向蛋白剪接的抑制劑，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)并有可能具有潛在的抗癌藥理作用。

（6）3KXN 是酪蛋白激酶2α 亞基（casein kinase 2α，Ck2α）。蛋白激酶Ck2α 是絲氨酸/蘇氨酸激酶CK2催化亞基的一種亞型，研究發(fā)現(xiàn)，CK2α 基因可能是原癌基因，在細(xì)胞中過度表達(dá)可引起癌變，并且CK2α 在增殖和腫瘤細(xì)胞中活性較正常細(xì)胞明顯升高，能參與包括肝細(xì)胞癌（HCC）在內(nèi)的各種惡性腫瘤的發(fā)生[17]。圖9為異香橙烯與3KXN 相互作用圖。

圖9 異香橙烯與3KXN相互作用圖（左3D，右2D）

異香橙烯與3KXN 通過烴基相互作用；預(yù)測(cè)異香橙烯可抑制CK2α 激酶活性，阻止肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的發(fā)生。

4 結(jié)論

本文通過反向找靶技術(shù)，在含有藥效團(tuán)模型的靶標(biāo)庫(kù)中搜尋，得到白術(shù)揮發(fā)油的主要成分契合度fitvalue 值大于0.9的靶標(biāo)蛋白，然后利用分子對(duì)接查看配體-受體間的非鍵相互作用，最后查閱靶點(diǎn)蛋白的生理功能，預(yù)測(cè)白術(shù)主要成分藥效。結(jié)果表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮、β-欖香烯、香橙烯和異香橙烯分子7種成分均與抗癌或抗腫瘤靶標(biāo)蛋白有相互作用，其中蒼術(shù)酮還與兼有抗炎和免疫調(diào)節(jié)靶標(biāo)蛋白有相互作用。其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ作用于酪蛋白激酶2，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作用于MDMX 蛋白，蒼術(shù)酮作用于維生素D3羥化酶，β-欖香烯作用于細(xì)胞周期蛋白A 和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2的復(fù)合物，香橙烯作用于CDC樣激酶3，異香橙烯作用于酪蛋白激酶2α亞基。綜上，白術(shù)揮發(fā)油的主要成分主要具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗炎的藥效，為白術(shù)在治療疾病方面的研究提供了理論依據(jù)。

致謝：感謝全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目資助（中壓制備色譜快速制備莪術(shù)有效成分研究，項(xiàng)目編號(hào)：201810375043；黃山地道中藥祁術(shù)主要成分作用靶點(diǎn)及作用機(jī)理，項(xiàng)目編號(hào)：201810375113）。感謝黃山學(xué)院校級(jí)科研平臺(tái)藥物設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（kypt201810）。