不同針刺干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠對NF-κB信號通路的調(diào)控影響*

李惠娟,張 棟,張曉哲,阮安民,陳 譜,周 俊,樊小燕,劉思婷,田 宇,沈家豪,彭浩軒,楊統(tǒng)杰,王慶甫

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是以膝關(guān)節(jié)軟組織炎癥為主的退行性骨關(guān)節(jié)常見病,其病因病機目前尚未清楚。針刀療法作為一種新的中醫(yī)微創(chuàng)技術(shù),近幾年在治療KOA有了滿意的臨床療效[1]。本實驗以KOA大鼠為研究對象,分別對大鼠內(nèi)、外膝眼穴進行于預(yù),使用針刀與相同直徑的圓利針,行相同的針刀手法,針刀具有刀鋒,而圓利針不具有。并觀察大鼠行為學(xué)、軟骨組織學(xué)及膝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65 mRNA和IKB-α mRNA表達的影響。利用此研究,相信更能確切比較出圓利針的“針”與針刀的“刀”的不同差別,并進一步揭示針刀治療KOA的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康清潔級,雄性8周齡Wistar大鼠體質(zhì)量(0.17±0.01)kg。由北京市維通力華實驗動物有限公司提供,許可證號: SCXK(京)2016-0006,在中日友好醫(yī)院實驗動物中心動物室喂養(yǎng),許可證號:SYXK(京)2016-0043。實驗動物適應(yīng)3 d后,將40只大鼠隨機分為正常組、造模組、針刀組和圓利針組,每組10只。在實驗過程中,對動物的處置符合動物倫理學(xué)。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 主要針具 一次性無菌針刀,規(guī)格:0.35 mm×25 mm(樂灸牌,馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司);一次性無菌圓利針,規(guī)格:0.35 mm×25 mm(樂灸牌,馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司)。

1.2.2 主要試劑 木瓜蛋白酶(RH31265);L-半胱氨酸(RH32452);蘇木素染色液(Harris粵珠械備20170022);伊紅染色液(水溶性粵珠械備20170022);TRIZOL(Invitrogen,10296028);無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,10009218);異丙醇(國藥,40064360);DEPC(MDL,MD911875);UltraPure Agarose(ABI-invitrogen,16500100);SuperScript III RT 逆轉(zhuǎn)錄kit(ABI-invitrogen,11752050);Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen,4472920)。

1.2.3 主要儀器 石蠟切片機(萊卡,德國,RM2206);組織石蠟包埋機(萊卡,德國,EG1150);數(shù)字切片掃瞄系統(tǒng)(奧林巴斯,美國,BX61VS);臺式高速冷凍離心機(THERMO,美國,LEGEND MICRO 21R);分光光度計(THERMO,Nanodrop lite);移液器(Eppendorf);熒光定量PCR儀(Applied biosystems,美國,StepOne Software);電泳儀(biorad,EPS 300);凝膠成像儀(biorad,2500)。

1.3 大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎造模方法

參照兔膝關(guān)節(jié)腔注射不同濃度的木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合液誘導(dǎo)KOA模型的方法[2]。

木瓜蛋白酶造模方案:造模開始的第1、4、7天,于模型組大鼠右后膝關(guān)節(jié)腔注射藥物(4%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L濃度的L-半胱氨酸以1∶1比例,混勻靜置0.5 h),0.22 μm濾膜過濾,4℃?zhèn)溆?。將大鼠右后膝周圍絨毛剃除,濕紗布擦洗后用碘伏消毒。大鼠左后膝絨毛,也一并剃除,每周測量左右膝周徑。在注射木瓜蛋白酶混合藥物時,左手將大鼠右后膝輕微上屈,右手持1 mL的注射器從髕骨內(nèi)側(cè)刺入關(guān)節(jié)腔,每次注射量100 μL。注射7 d后,圈養(yǎng)大鼠4周,誘導(dǎo)大鼠KOA模型。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 正常組 正常飼養(yǎng),不做任何干預(yù)。

1.4.2 造模組 造模后,不做任何干預(yù)治療。

1.4.3 針刀組 造模成功后第3天,進行針刀干預(yù),每周1次,共治4周。

1.4.4 圓利針組 于造模成功后第3天針刺,使用與針刀相同直徑的圓利針,行與針刀組相同的手法,每周1次,共治4周。

圓利針組、針刀組均選取內(nèi)、外膝眼穴。兩穴均參考《實驗針灸學(xué)》[3]中“常用實驗動物針灸穴位”進行治療。兩穴位于髕韌帶兩側(cè)凹陷處,直刺約3 mm;所有干預(yù)結(jié)束后1周取材。針刀組與圓利針組,具體操作與治療步驟如下:造模成功后,將Wistar造模大鼠固定于治療臺上,在鼠膝關(guān)節(jié)選取內(nèi)、外膝眼穴作為針刀進針點,以龍膽紫定位標記,常規(guī)性消毒,然后針刀刺入,刀口線與韌帶方向平行,針體與皮膚垂直,刺入約3 mm,出針刀并用棉球按壓3 min止血。每周干預(yù)1次，共4周。

1.5 行為學(xué)檢測方法

干預(yù)前和干預(yù)后1周的兩個時間點,應(yīng)用改良Lequesne MG[4]的膝關(guān)節(jié)評估法對正常組、造模組、針刀組和圓利針組的鼠膝關(guān)節(jié)進行行為學(xué)評價,觀察項目包括步態(tài)改變、疼痛刺激反應(yīng)、關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)活動等4個部分。

1.6 取材及指標檢測

治療結(jié)束1周后,處死大鼠進行取材,在超凈工作臺上,快速取出右后膝關(guān)節(jié)滑膜組織,一部分置于凍存管內(nèi),液氮迅速冷凍保存,用于Real-time PCR檢測。另一部分取軟骨,10%中性多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片和HE染色，于光鏡下觀察組織,根據(jù)Mankin評價鼠膝KOA模型病理分期。

1.6.1 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法 PCR檢測滑膜組織NF-κBp65和IKB-α基因表達水平,將滑膜組織從液氮中取出,在預(yù)冷的研缽中加入液氮快速研磨成粉末,將粉末放置于預(yù)冷的離心管中,具體步驟按照試劑盒要求進行。具體引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6.2 Mankin軟骨組織學(xué)評分檢測方法 Mankin軟骨組織學(xué)[5]檢測對正常組、造模組、針刀組和圓利針組鼠膝關(guān)節(jié)進行軟骨組織學(xué)評價,觀察項目包括蛋白多糖(HE染色法)、結(jié)構(gòu)、細胞和潮線完整性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,定量資料以均數(shù)±標準差表示。組間比較先行檢驗各組的數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析(Independent sample t test)和單因素方差分析(One-way ANOVA)，若不符合正態(tài)分布,則應(yīng)用非參數(shù)檢驗分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評價比較

干預(yù)前造模組、針刀組、圓利針組均顯著高于正常組(P<0.01);干預(yù)后針刀組、圓利針組均顯著低于造模組(P<0.01)。見表2。

表2 Lequesne MG動物行為學(xué)評分結(jié)果

2.2 各組大鼠右后膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察

2.2.1 正常組 軟骨區(qū)域的潮線清晰可見,同源細胞群清晰可見。軟骨細胞大小均一。軟骨表面光滑,無血管翳生成。見圖1。

2.2.2 造模組 軟骨細胞增生,軟骨潮線消失。軟骨基質(zhì)增生,厚度增加。軟骨表面細胞破壞嚴重,表層軟骨細胞稀少。血管翳普遍存在,新生血管出現(xiàn)。見圖1。

2.2.3 針刀組 軟骨潮線清晰可見,軟骨細胞排列正常,未見軟骨細胞增生。軟骨表面較光滑,偶見血管翳生成。見圖1。

2.2.4 圓利針組 部分潮線模糊斷裂,軟骨細胞基本呈正常狀態(tài),表層軟骨細胞較正常組減少。有少量血管翳形成。見圖1。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin軟骨組織學(xué)評價比較

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨切片HE染色后,以100倍和400倍光鏡觀察，見圖1?？梢婈P(guān)節(jié)軟骨分為淺表層、中間層、深層和鈣化層4個區(qū)域,其中深層和鈣化層之間有一層清晰的邊界稱為潮線,并應(yīng)用Mankin軟骨組織學(xué)評價軟骨破壞程度。

圖1 各組大鼠右后膝關(guān)節(jié)軟骨切片HE染色結(jié)果

各組組間評分比較針刀組與圓利針組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),造模組、針刀組、圓利針組評分均顯著高于正常組(P<0.01),針刀組、圓利針組評分均顯著低于造模組(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠Mankin軟骨組織學(xué)評分

2.4 各組大鼠實時熒光定量比較

PCR檢測滑膜NF-κBp65、IKB-α基因表達。NF-кB信號通路關(guān)鍵元件IKB-α mRNA和NF-κBp65 mRNA各組表達水平比較,NF-κBp65 mRNA表達在針刀組、圓利針組和造模組均顯著高于正常組(P<0.01),IKB-α mRNA表達在針刀組、圓利針組均高于造模組(P<0.05),針刀組高于圓利針組和造模組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠滑膜組織NF-κBp65 mRNA和IKB-α mRNA水平比較

3 討論

本實驗應(yīng)用改良的Lequesne MG評估法觀察大鼠動物行為學(xué),造模組與正常組的行為學(xué)評分呈正相關(guān),表明木瓜蛋白酶成功的模擬KOA所致的膝關(guān)節(jié)功能受限的狀態(tài)。干預(yù)后針刀組、圓利針組的Lequesne MG評分均與造模組呈負相關(guān),表明針刀治療和圓利針治療均可以有效改善KOA模型動物的膝關(guān)節(jié)功能,而針刀組在緩解疼痛和改善膝關(guān)節(jié)功能方面的評分均優(yōu)于圓利針組。

膝關(guān)節(jié)軟組織的疼痛是KOA最主要的臨床癥狀,疼痛包含了靜息疼痛和牽涉疼痛等,而疼痛會進一步造成膝關(guān)節(jié)功能(如步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動受限)的下降,臨床治療的主要目的就是為了改善疼痛癥狀。在本實驗中采用了圓利針干預(yù)組為陽性對照組,從改善膝關(guān)節(jié)功能和緩解疼痛等這幾方面對比針刀干預(yù)的療效,并深入探討針刀治療的作用機制。臨床上,由于多種原因?qū)е翶OA的一些臨床表現(xiàn),包括膝周軟組織發(fā)生黏連和攣縮、屈伸受限出現(xiàn)僵硬現(xiàn)象或伴隨患側(cè)的股四頭肌痙攣萎縮、正常肌力下降等問題,嚴重影響了病患的日常生活[6]。

在Mankin軟骨組織學(xué)評價方面，造模組評分與正常組呈明顯正相關(guān)(P<0.01),說明木瓜蛋白酶很好的模擬了KOA的病理表現(xiàn)。針刀組、圓利針組評分均與造模組呈負相關(guān)(P<0.01),說明了兩個治療組與造模組相比較均有所改善,且其中針刀組改善程度顯著高于圓利針組。從HE染色切片結(jié)果顯示,針刀組治療效果優(yōu)于圓利針，這與覃蔚嵐[7]、嵇波[8]等學(xué)者的研究結(jié)果一致，針刀療法可降低KOA軟骨退變,有助于形成軟骨母細胞的趨勢,并可促進軟骨新生纖維和骨細胞的形成。

膝關(guān)節(jié)軟骨附著在髕股和脛股關(guān)節(jié)的表面,發(fā)揮了減震和潤滑的功能[9]。在KOA疾病的進程中,關(guān)節(jié)軟骨一方面因為力學(xué)環(huán)境改變,使得運動軌跡發(fā)生異常;另一方面因膝周無菌性炎癥擴展,導(dǎo)致關(guān)節(jié)液中的炎性因子含量升高,致使代謝發(fā)生異常進而加速了軟骨的退變。本課題組前期實驗研究[10-11]表明,軟組織滑膜炎癥是KOA的重要病理變化,與KOA的骨性結(jié)構(gòu)破壞有密切相關(guān)。從本課題組前期臨床研究[12]亦可發(fā)現(xiàn),早期KOA以無菌性軟組織炎癥表現(xiàn)為主,針刀治療可明顯改善滑膜炎癥增生,進而緩解KOA癥狀。在晚期,KOA軟組織炎癥逐漸減退,關(guān)節(jié)軟骨的破壞成為主要病理表現(xiàn)。

前期研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路在KOA滑膜炎癥中,軟骨破壞激活表達顯著[13]。在不同階段的KOA,軟骨和滑膜組織也顯著表達,并與KOA分期的軟骨形態(tài)學(xué)改變有明顯相關(guān)性[14]。NF-κB包括NF-κB家族及其抑制物IKB家族,調(diào)控著炎癥基因和多種免疫的信號傳導(dǎo)[15]。NF-κB在正常的生理機能中有重要作用，并參與了KOA多種病理性激活和軟骨細胞前炎癥因子表達[16-17]。NF-κB抑制因子IKB家族成員中,IKB-α是最早被克隆的分子,也是至為重要的。IKB泛素化后被蛋白水解酶降解,使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活,啟動前炎性因子特異性的基因轉(zhuǎn)錄和表達[18-19]。

在本實驗中發(fā)現(xiàn),與正常組相比較，造模組膝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65 mRNA含量明顯增高(P<0.01),IKB-α mRNA含量明顯降低(P<0.05),說明在KOA的炎癥反應(yīng)過程中有NF-κB信號傳導(dǎo)機制參與;與造模組相比較,針刀組膝關(guān)節(jié)滑膜軟組織中NF-κBp65 mRNA含量明顯降低(P<0.01),IKB-α mRNA含量值明顯增高,表明針刀對KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟組織中NF-κBp65 mRNA的表達有抑制作用，而IKB-α mRNA 表達有升高的作用,這說明了針刀干預(yù)可改善大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜軟組織中NF-κB的高調(diào)控狀態(tài)，從而抑制滑膜炎性細胞因子和炎性介質(zhì)的合成與分泌，這有可能是針刀實現(xiàn)其抗炎效應(yīng)并治療KOA的作用機理之一。

本實驗初步探索了Wistar大鼠行為學(xué)、軟骨組織學(xué)和滑膜組織基因在KOA模型中的變化情況,并采用了刺激強度和刺激量都比一般毫針作用大的針刀和圓利針進行治療。從臨床可知,針刀最主要切割的是肌筋膜,對軟組織附著的肌筋膜進行切割,使肌肉軟組織的內(nèi)壓減小,肌痙攣也隨之解除[20]。王常海等[21]在研究報告中也明確指出,針刀醫(yī)學(xué)對KOA的認識在于膝關(guān)節(jié)和其周圍保持恒定的動態(tài)力學(xué)平衡。針刀具有“刀”以及“針”的雙重作用,“刀”可對軟組織進行松解,調(diào)節(jié)軟組織的力學(xué)平衡,起到一定減壓作用。而“針”能緩解局部疼痛,改善微循環(huán),達到“通則不痛”的治療目的。對照組采用圓利針療法是因為圓利針的治療思路和針刀相近,在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,以現(xiàn)代運動醫(yī)學(xué)和解剖學(xué)為原則,通過松解手法對粘連的軟組織進行剝離,可對膝周的陽性反應(yīng)點形成多個減壓通道,能降低內(nèi)部組織的壓力,改善痙攣狀態(tài),促進膝關(guān)節(jié)的力學(xué)失調(diào)達到平衡[22]。

綜上所述,KOA軟組織痙攣處通過針刀進行剝離與切割,打破KOA發(fā)病機制的惡性循環(huán),改善膝關(guān)節(jié)動態(tài)平衡,促進動物行為學(xué)評分,改善滑膜組織NF-кB信號通路的高調(diào)控狀態(tài)，從而抑制滑膜炎性因子和介質(zhì)的合成與分泌,這有可能是針刀實現(xiàn)其治療KOA的作用機制之一。