低鹽處理對長牡蠣胚胎發(fā)育及氧化應(yīng)激、能量供應(yīng)和滲透調(diào)節(jié)相關(guān)酶的影響*

李陽春，王昭萍，馬培振，張學(xué)開，范 超，崔玉婷

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

鹽度是影響海洋生物生長存活的重要環(huán)境因子，作為具有滲透生理適應(yīng)性的生物，貝類對鹽度變化的適應(yīng)范圍很廣[1]。然而，鹽度的驟變?nèi)詴ω愵惍a(chǎn)生多方面的不利影響，例如，妨礙其正常的攝食、呼吸，影響心跳、鰓纖毛運動，導(dǎo)致其血淋巴鈉離子濃度降低、免疫功能受到抑制等，最終使得貝類生長緩慢、死亡率升高[2-6]。

貝類增養(yǎng)殖在國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中都占有重要地位，三倍體貝類以其生長快、個體大、糖原含量高、繁殖季節(jié)肥滿度高、死亡率低[7]等優(yōu)點，具有極高的生產(chǎn)推廣價值。近年來，低鹽誘導(dǎo)三倍體的方法由于具有誘導(dǎo)率高、操作簡便、無毒無害、成本低廉等優(yōu)點，已經(jīng)在長牡蠣(Crassostreagigas)[7-8]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[9]、海灣扇貝(Argopectenirradians)[10]、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[11]等多種貝類中開展了研究。低鹽誘導(dǎo)已被證明會顯著降低受精卵的卵裂率和孵化率[7]，然而其對貝類胚胎發(fā)育速度及發(fā)育過程中生理生化水平的影響尚未見報道。

牡蠣作為重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類類群,其總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量在諸多貝類類群中均居首位(1)FAO Yearbook.Fishery and Aquaculture Statistics 2016.accessed 14 October 2018.http://www.fao.org/fishery/publications/yearbooks/en。本實驗選取長牡蠣為研究對象，探究了低滲誘導(dǎo)過程對其胚胎發(fā)育和發(fā)育初期部分酶活力的影響。由于能量代謝、抗氧化、滲透調(diào)節(jié)方面的改變都可能影響受精卵染色體的正確分離與細(xì)胞的正常分裂，因此本實驗結(jié)果也能為進(jìn)一步探究低鹽誘導(dǎo)貝類三倍體的分子機理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用2齡親貝(殼長8～15 cm)采自煙臺海益苗業(yè)有限公司，挑選外殼無損傷、活力好的個體，洗刷干凈待用。

1.2 方法

1.2.1 精卵獲取及受精 實驗用海水為過濾自然海水(鹽度32，水溫23～25℃)，器械在操作前均用淡水清洗，嚴(yán)格防止精卵污染。親貝開殼后用牙簽挑取適量性腺鏡檢，區(qū)分雌雄。擠壓雌性親貝性腺取卵，卵液用200目篩絹過濾去除殘余組織，后用500目篩絹過濾沖洗2～3遍，浸泡50 min促熟，鏡檢，選取發(fā)育程度較好的卵子(卵內(nèi)物質(zhì)致密、卵子形狀近圓)混合，調(diào)整卵子密度為7 000～8 000個/mL[12]。受精前解剖取精子，300目篩絹過濾，浸泡10 min左右，挑選精子活力高的精液，以卵子∶精子=1∶(5～6)的比例進(jìn)行受精。精卵混合5～10 min后，用1 000目篩絹洗卵，去除多余精子，鏡檢觀察極體出現(xiàn)情況。

1.2.2 低鹽誘導(dǎo)處理及胚胎發(fā)育觀察 根據(jù)之前研究的結(jié)果，本研究采用的誘導(dǎo)時間為15 min；誘導(dǎo)時機為40%～50%受精卵出現(xiàn)第一極體[7-8]，處理鹽度的范圍為4～18，每2個鹽度設(shè)立一個梯度。低鹽處理后轉(zhuǎn)入過濾自然海水(20 L小桶)中繼續(xù)培養(yǎng)，期間保持充氣，定期攪桶避免沉底，孵化期間定時取樣觀察胚胎發(fā)育情況，直至發(fā)育到D形幼蟲。發(fā)育時期判斷標(biāo)準(zhǔn)：80%幼蟲到達(dá)該時期為標(biāo)志，每次觀察至少3個視野，每個視野幼蟲個數(shù)50左右。

1.2.3 酶活測定 由于鹽度8為低鹽誘導(dǎo)長牡蠣三倍體的最佳鹽度[7-8]，因此本研究也選擇鹽度8作為處理鹽度。測定的四種指標(biāo)分別為：丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、Na+-K+-ATP酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase,GOT)和總抗氧化能力(Total- antioxidant capacity，T-AOC)。受精卵在經(jīng)低鹽誘導(dǎo)15 min后，處理組及對照組均平均分為兩份，一份立即離心取樣，另一份轉(zhuǎn)入自然海水中恢復(fù)1.5 h，再過濾離心取樣。實驗所用測定試劑盒分別為：Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型，碧云天，P0006C)，丙酮酸激酶(微量法，索萊寶，BC0545)，Na+-K+-ATP酶活性檢測試劑盒(微量法，索萊寶，BC0065)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性檢測試劑盒(微量法，索萊寶，BC1565)。具體測定方法參照說明書進(jìn)行，測定原理及酶活單位U的定義(按蛋白濃度計算)為：

(1)PK:可以催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化 NADH和丙酮酸生成乳酸和 NAD+，在340 nm下測定NADH下降速率，即可反映PK活性；定義每10 mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

(2)Na+-K+-ATPase:該酶能夠分解ATP生成ADP及無機磷，因此可以通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性。定義每小時每毫克組織蛋白中Na+-K+-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

(3)T-AOC:酸性條件下，物質(zhì)還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其總抗氧化能力。樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值(△A)所需的標(biāo)準(zhǔn)離子濃度表示。

(4)GOT:該酶可以催化天門冬氨酸和α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成草酰乙酸和谷氨酸，草酰乙酸脫羧生成丙酮酸，丙酮酸可與 2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成 2,4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境顯棕紅色，可以間接地代表GOT的活性。定義每小時每毫克組織蛋白催化產(chǎn)生1 μmol丙酮酸的量為一個GOT活力單位。

蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Abs = 0.032 2+0.587 8×Conc(濃度單位為mg/mL，R2=0.992 7)。

測定儀器：酶標(biāo)儀(MultiskanTMFC,Thermo ScientificTM,USA)。

1.2.2與1.2.3中的實驗均包含三個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)包含三個技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，配對樣本T檢驗常用來推斷同一受試對象接受兩種不同的處理或某一指標(biāo)在兩種不同情況下總體的均值是否存在顯著差異[13]，因此本研究采用配對樣本T檢驗作為分析方法，差異顯著性閾值為0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 低鹽誘導(dǎo)對長牡蠣胚胎發(fā)育的影響

受精卵經(jīng)低鹽誘導(dǎo)之后培育1 d，發(fā)育情況見表1。由表1中結(jié)果可得，本實驗中牡蠣的發(fā)育較快，對照組19 h左右即到達(dá)D形幼蟲期，而一般情況下(水溫20～23 ℃)到達(dá)D形的時間普遍為23～24 h[14]，這可能是由于本實驗的孵化水溫較高(24～25 ℃)所致。同時，不同低鹽處理對受精卵胚胎發(fā)育不同時期的影響也不同：(1)二細(xì)胞期，所有組別的發(fā)育速度無顯著差異；(2)四細(xì)胞和囊胚期，不同處理鹽度發(fā)育速度出現(xiàn)明顯斷層：32、18、16>14、12、10、8 >6、4，說明鹽度18和16處理對受精卵發(fā)育沒有顯著抑制作用，鹽度8～14對受精卵發(fā)育的阻礙作用效果類似，且并未造成發(fā)育嚴(yán)重滯后(僅延緩0.5 h左右)，而鹽度4和6對受精卵發(fā)育的阻礙作用較為嚴(yán)重，滯后時間達(dá)到1 h左右；(3)原腸胚和D形幼蟲期，發(fā)育速度的大小為:32、18、16>14、12 >10、8>6>4，這與之前研究所得出的孵化率趨勢相吻合[7-8]，4組D形幼蟲期比對照組延緩了4 h以上，且孵化率極低(<10%)，說明較低鹽度的處理會對受精卵的孵化造成嚴(yán)重的阻礙。

表1 不同誘導(dǎo)鹽度下長牡蠣的胚胎發(fā)育Table 1 Embryonic development under different inducing salinities

2.2 低鹽處理對長牡蠣胚胎發(fā)育初期能量代謝、抗氧化及滲透調(diào)節(jié)的影響

2.2.1 低鹽處理15 min及恢復(fù)1.5 h后各種酶活性的改變 本實驗通過對低鹽誘導(dǎo)15 min后處理組和對照組之間的酶活水平進(jìn)行比較，反映了低鹽處理對受精卵的即時影響；同時，由發(fā)育數(shù)據(jù)可看出，四細(xì)胞期(大約為處理完轉(zhuǎn)入自然海水恢復(fù)1.5 h左右)，各組發(fā)育速度雖無顯著差異，但鹽度4～12的處理組已經(jīng)開始表現(xiàn)出一定的發(fā)育遲緩，因此，本實驗還選擇通過檢測此時期組間的酶活水平，來探究是否由于酶活變化導(dǎo)致此時期發(fā)育的遲緩，結(jié)果如圖1所示。

圖1中可看出，處理15 min后，PK和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，而T-AOC顯著增加(且達(dá)到極顯著水平)，GOT 無明顯改變；恢復(fù)1.5 h之后，除T-AOC外，所有酶的酶活水平在處理組和對照組之間皆無顯著差異，說明經(jīng)過一段時間的恢復(fù)，酶活水平也已基本恢復(fù)到正常的水平。對于T-AOC，處理組與對照組間雖存在差異，但并未到達(dá)極顯著水平，且兩組間T-AOC水平均值較為相近(S和CK組分別為：0.863±0.049、0.976±0.037)，這說明處理組T-AOC水平在1.5 h的恢復(fù)過程中發(fā)生了回落，逐漸接近對照組水平。

2.2.2 同種酶在處理組、對照組中不同發(fā)育時期的活性 為探究受精卵能量代謝、滲透調(diào)節(jié)及抗氧化能力與胚胎發(fā)育時期的關(guān)系，本實驗分別比較了處理組和對照組中，上述4種酶的活性在處理15 min及恢復(fù)1.5 h后是否有顯著差異，結(jié)果見表2。從表2中可看出，所有指標(biāo)在CK-15 min組和CK-1.5 h組間均無顯著差異(P>0.05)，說明在對照組中這4種酶的酶活水平一直保持穩(wěn)定；而S-15 min組和S-1.5 h組中，Na+-K+-ATP酶水平顯著上升(P=0.032)，PK與T-AOC水平改變雖未達(dá)到顯著水平，但十分接近顯著性水平閾值(P值分別為0.057,0.055)說明在受精2h后，這3種酶的活性與處理15 min時相比發(fā)生了顯著的改變，且都基本恢復(fù)到與對照組類似的水平，說明在自然海水中恢復(fù)1.5 h后，上述4種酶的活性與對照組間水平基本相當(dāng)，這與2.2.1中得到的結(jié)果是一致的。從而說明，恢復(fù)1.5 h之后，酶活水平并不是造成受精卵發(fā)育遲緩的主要原因。

(S代表低鹽處理組，CK代表對照組；15 min代表處理后立即測定，1.5 h代表恢復(fù)后測定；S與CK同一時期的同種酶之間具有相同字母的差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母者差異顯著(P>0.05),*表示差異極顯著(P<0.01)。S refers to the treatment group,CK refers to the control group.15 min means to measure the enzyme activities right after hypotonic treatment;1.5 h means to measure after recovering in normal sea water.Different letters indicate significant differences in certain enzyme activities between S and CK groups at 15 min and 1.5h respectively (P>0.05),* indicates the very significant difference (P<0.01).)圖1 處理15 min及恢復(fù)1.5 h酶活水平的比較Fig.1 Enzyme activities after hypotonic treatment for 15 min and recovery for 1.5 h

表2 處理組和對照組組內(nèi)的配對樣本T檢驗Table 2 Pared-sample T test between the control and treatment group

3 討論

3.1 低鹽誘導(dǎo)對牡蠣胚胎發(fā)育的影響

鹽度是影響貝類生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一。本研究證明，對釋放了第一極體的長牡蠣受精卵用鹽度8處理15 min，在誘導(dǎo)其產(chǎn)生多倍體的同時還會導(dǎo)致其胚胎發(fā)育明顯受阻。孟乾等[15]認(rèn)為長牡蠣“海大1號”胚胎發(fā)育的最適環(huán)境鹽度為30，二者的研究都表明，鹽度偏離最適值時，孵化速度都會明顯減慢，伴隨著孵化率的降低和畸形率的升高。同時，孟乾等[15]的研究還顯示環(huán)境鹽度10以下牡蠣受精卵即無法孵化，而本研究中鹽度為4仍有極少量幼蟲孵化，這可能是因為孵化期間高、低鹽的刺激對牡蠣胚胎發(fā)育的阻礙是持續(xù)性的，而本實驗僅在減數(shù)第二次分裂時期對幼蟲進(jìn)行了短暫時間(15 min)的低鹽處理，并未進(jìn)行長時間脅迫，因此對受精卵孵化產(chǎn)生的影響有限。此外，陳洪發(fā)等[8]的研究表明，親貝的培育鹽度，以及誘導(dǎo)完成后至孵化出D形幼蟲這一階段的環(huán)境鹽度對于三倍體的誘導(dǎo)效果也有顯著影響：培育鹽度為26、30、34和38時，誘導(dǎo)最佳鹽度為8；而環(huán)境鹽度為22時，最適誘導(dǎo)鹽度為6；同時，環(huán)境鹽度過高(鹽度為38)時，卵裂率和孵化率均顯著下降，提示在不同鹽度的養(yǎng)殖海區(qū)開展低鹽誘導(dǎo)牡蠣三倍體工作時，應(yīng)充分考慮海區(qū)鹽度對三倍體誘導(dǎo)效果的影響。

3.2 低鹽誘導(dǎo)對胚胎發(fā)育初期能量供應(yīng)、氧化應(yīng)激和滲透調(diào)節(jié)的影響

低鹽條件下，為滿足個體的滲透調(diào)節(jié)需要及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持，貝類的能量需求通常會增加[1，16]；滲透壓的急劇下降還會誘發(fā)活性氧的瞬間增加，引起抗氧化酶活性的改變[17]。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK) 可以催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一[18]；谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase,GOT)可以催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，是氨基酸代謝的重要酶[19]；Na+-K+-ATP酶(又稱鈉鉀泵，Sodium potassium pump)能夠利用ATP水解供能調(diào)控Na+和K+的跨膜轉(zhuǎn)運，維持胞漿離子濃度，在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]；而總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒則是測定細(xì)胞中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，可以反映出受精卵的氧化應(yīng)激情況。

本實驗中，低鹽誘導(dǎo)15 min后，處理組中丙酮酸激酶的活性有顯著降低，說明低滲條件下貝類的能量供應(yīng)(尤其是糖酵解產(chǎn)生ATP的過程)受到了一定抑制；而GOT 無顯著變化則說明此時段GOT相關(guān)的氨基酸代謝沒有受到顯著影響，并未由于葡萄糖代謝供能受阻轉(zhuǎn)而提高氨基酸代謝供能水平。同時，總抗氧化能力(T-AOC)水平有顯著增加，間接反映了低鹽環(huán)境對貝類產(chǎn)生的氧化脅迫。減數(shù)分裂期間紡錘體的組裝、染色體的分離及收縮環(huán)的形成都很容易受到外界環(huán)境改變(如ATP合成受阻等)的影響，導(dǎo)致分裂異常從而產(chǎn)生多倍體[21-24]，因此，受精卵能量代謝的不足及氧化損傷可能是低鹽處理產(chǎn)生三倍體的原因之一。

低滲環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)的Na+會發(fā)生外流，為維持細(xì)胞滲透平衡，通常需要Na+-K+-ATP酶的作用以促進(jìn)Na+的主動吸收，因此該酶活性往往會升高[25-27]；然而前人研究也報道了其活性在低滲條件下的多種變化趨勢，與物種及其所處的溫、鹽環(huán)境都密切相關(guān)。田相利等的研究表明，半滑舌鰨鰓絲Na+-K+-ATP酶活性隨鹽度的升高而升高[28]；在華貴櫛孔扇貝幼貝中開展的研究結(jié)果顯示，Na+-K+-ATP酶的活性隨著鹽度的升高先升后降[29]；而在黑鯛和褐牙鲆幼魚中開展的研究則表明，鹽度變化對其Na+-K+-ATP酶活性的影響并不顯著[30-31]。對于牡蠣受精卵來說，其細(xì)胞膜在低滲條件下會受到直接的破壞，可能導(dǎo)致膜上Na+-K+-ATP酶活性的降低[29]；同時，牡蠣在胚胎發(fā)育初期缺乏復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這也可能是其Na+-K+-ATP酶活性在滲透脅迫條件下不升反降的原因之一。

轉(zhuǎn)入自然海水恢復(fù)1.5 h后，這3種酶的水平基本恢復(fù)了正常，說明短暫的低滲處理對受精卵能量代謝、氧化應(yīng)激和滲透調(diào)節(jié)的影響是暫時性的，它可能是誘導(dǎo)三倍體產(chǎn)生的原因，但不一定是后期胚胎發(fā)育受阻的主要因素。本課題組近期的研究顯示(未發(fā)表)，低鹽處理會對受精卵DNA造成難以修復(fù)的損傷，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生嚴(yán)重的錯誤，這可能是導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形和速度減慢的原因之一。

此外，當(dāng)滲透壓降低時，僅依靠糖代謝往往難以滿足急劇增加的能量需求，海洋生物傾向于提高蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解以提供額外的能量[32-33]。同時，通過脫氨基作用可以減少細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸的含量，降低體內(nèi)的滲透壓，從而應(yīng)對外界的低鹽環(huán)境[34]。谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)可以催化脫氨基作用，是促進(jìn)氨基酸分解和蛋白質(zhì)的供能的關(guān)鍵酶之一。本實驗中，GOT的含量一直都未發(fā)生顯著改變，說明此時段氨基酸的代謝水平并沒有受到葡萄糖代謝供能受阻的影響，細(xì)胞也并未通過增加氨基酸代謝來降低胞內(nèi)滲透壓，以維持與外界的滲透平衡?？紤]到受精卵作為一個單細(xì)胞個體，并不具備多細(xì)胞貝類成體復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)，同時短時間的低鹽處理(15 min)可能也不足以給受精卵提供足夠的時間對外界環(huán)境改變做出相應(yīng)的響應(yīng)[35]，因此在氨基酸代謝方面并沒有顯著的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)然，僅檢測GOT一個酶的水平并不能說明氨基酸代謝一定沒有發(fā)生改變，更全面的分析還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)語

本研究觀察了低鹽誘導(dǎo)對長牡蠣三倍體胚胎發(fā)育的影響，及其抗氧化和能量代謝相關(guān)酶活性的改變。結(jié)果表明，低鹽誘導(dǎo)會導(dǎo)致牡蠣胚胎發(fā)育嚴(yán)重遲緩，到達(dá)D形幼蟲的時間最多延緩了4 h以上；同時，低鹽處理可能會導(dǎo)致牡蠣受精卵受到嚴(yán)重的氧化脅迫、糖代謝供能被抑制、滲透調(diào)節(jié)受阻，這可能是導(dǎo)致牡蠣受精卵染色體異常分離從而產(chǎn)生三倍體的原因之一。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究低滲誘導(dǎo)貝類三倍體的機理提供了重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。