山東省9 147例新生兒耳聾基因和聽力聯(lián)合篩查結果分析

孫毅 劉雅琳 劉曉莉 丁美玲 張斌

耳聾是影響人類健康和造成人類殘疾的常見原因，研究發(fā)現(xiàn)65%的耳聾是由遺傳引起的[1]；其可以由單一基因突變或多基因突變引起，也可以由環(huán)境因素或基因和環(huán)境因素共同導致。隨著新生兒聽力篩查工作的開展，發(fā)現(xiàn)常規(guī)聽力篩查存在一定的局限性，不能及時發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾。北京市新生兒遺傳性耳聾基因篩查研究發(fā)現(xiàn)25%的遺傳性耳聾被單純的聽力學篩查遺漏；耳聾基因篩查聯(lián)合聽力篩查有助于預知遲發(fā)性耳聾和藥物性耳聾，同時做到有目的性的隨訪和臨床干預[2～5]。本研究擬通過分析近年來山東地區(qū)新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查結果，探討該地區(qū)新生兒耳聾基因聯(lián)合聽力篩查的臨床意義，為該方法的推廣應用提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象 以2017年6月至2018年11月在山東省內各地分娩的新生兒9 147例為研究對象(不含重癥監(jiān)護室新生兒)，篩查前明確告知聽力篩查和耳聾基因篩查相關知識，監(jiān)護人或家屬簽訂知情同意書。

1.2新生兒聽力篩查及診斷方法

1.2.1聽力篩查和診斷流程 新生兒在出生48小時后，在自然睡眠狀態(tài)下，于環(huán)境噪聲小于40 dB A的房間使用畸變產物耳聲發(fā)射(DPOAE)進行聽力初篩，初篩未通過者要求在30～42天內使用自動聽性腦干反應(AABR)進行聽力復篩。復篩未通過者將檢測結果告知家長，并要求3月齡時應用聽性腦干反應(ABR)進行聽力診斷。

1.2.2聽力篩查方法 使用德國MAICO公司生產的Ero scan型耳聲發(fā)射儀進行初篩，①DPOAE檢測，測試時間5～7秒，刺激強度40～70 dB SPL,測試頻率2～5 kHz，設備自動顯示“通過”或“未通過”“轉診”。②AABR檢測：采用德國MAICO的MB11篩查AABR模塊進行復篩，刺激強度35 dB nHL，測試頻率0.75～5 kHz，刺激信號為CE-Chirp聲，儀器自動顯示 “通過”或“未通過”“轉診”。

1.2.3聽力診斷方法 復篩未通過者清除外耳道耵聹后，進行聽力學診斷。ABR檢測：采用德國MAICO生產的MB11型檢測儀標準ABR模塊。以反應閾<30 dB nHL為正常，31～50 dB nHL為輕度聽力損失，51～70 dB nHL為中度聽力損失，71～90 dB nHL為重度聽力損失，>91 dB nHL為極重度聽力損失。

1.3耳聾基因檢測方法 新生兒出生3天后，由各助產機構用采血卡濾紙采集新生兒足跟末梢血2個血斑，每個血斑直徑不小于8 mm，室溫下自然晾干后裝入帶速封條的塑料袋內，每周派專人送至山東省康復研究中心耳聾基因篩查實驗室對標本進行檢測，共檢測4個常見的耳聾基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA12SrRNA)，包括15個耳聾突變位點，GJB2(35delG、 176del16、235delC、299_300delAT)、SLC26A4 (1174A>T、1226 G>A、1229 C>T、1975 G >C、2027T>A、 IVS15+5G>A、IVS7-2A>G、2168A>G)、mtDNA12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)，并在30天內將檢測結果反饋至新生兒出生分娩機構。

檢測流程：采用天根干血斑核酸提取試劑盒(DP334-03)對干血斑進行基因組DNA提取，使用Nano DRrop2000對提取的DNA進行濃度檢測，濃度合格后使用PCR擴增儀對目的基因片段進行擴增(杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b))，后使用晶芯BioMixer TM 芯片雜交儀、晶芯SlideWasher TM洗干儀和LuxScan TM 10K-A微陣列芯片掃描儀和遺傳性耳聾基因芯片判別系統(tǒng)(博奧晶典生物技術有限公司)對檢測結果進行判讀。每批樣本包含陰性、陽性對照組，以驗證芯片檢測結果的可靠性，同時隨機抽取5%的樣本以及檢測結果為陽性的樣本進行DNA測序，進一步驗證芯片檢測結果的準確性。

2 結果

2.1聽力篩查及診斷結果 9 147例新生兒中，初篩未通過172例(1.88%，172/9 147)，復篩未通過者94例(54.65%，94/172)，經聽力學診斷確診聽力損失患兒17例(表1)，占初篩未通過的9.88%(17/172)；其中，雙耳聽力損失10例，包括極重度2例，重度2例，中度1例，輕度4例，左耳輕度、右耳中度1例。單耳聽力損失極重度1例，中度2例，輕度1例。先天性小耳畸形2例，面部發(fā)育畸形、眼距異常伴雙耳極重度聽力損失1例。

表1 17例診斷聽力損失新生兒基因篩查突變類型、聽力損失程度及ABR反應閾

2.2基因篩查結果 9 147例新生兒全部進行十五個位點的耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變461例(表2)。致聾基因攜帶率5.04%(461/9 147)。篩查出GJB2基因雜合突變224例，攜帶率為2.45%，GJB3基因雜合突變27例，攜帶率0.30%；SLC26A4基因雜合突變186例，攜帶率2.03%；mtDNA12SrRNA均質和異質突變19例，攜帶率0.21%。GJB2純合突變2例，復合雜合突變1例，SLC26A4基因復合雜合突變1例。雙基因雜合突變5例。對耳聾基因檢測結果陽性患兒家長進行電話回訪，在461例陽性患兒中有103位家長未取得聯(lián)系，剩余358例耳聾基因檢測陽性患兒中19例未通過聽力初篩，進行了聽力學診斷，結果顯示有11例耳聾基因檢測陽性患兒聽力診斷異常。

表2 山東省9 147例新生兒耳聾基因篩查各基因突變類型、位點及攜帶率

2.3確診聽力損失患兒的基因篩查結果 在17例聽力損失患兒中耳聾基因檢測陰性6例，陽性11例，11例耳聾基因篩查陽性者中，攜帶GJB2基因突變者，包括：2例235delC純合突變，1例235delC/299_300delAT復合雜合突變，2例235delC雜合突變，1例299_300delAT雜合突變；攜帶SLC26A4基因突變者，包括1例IVS7-2A>G/2168A>G復合雜合突變，4例IVS7-2A>G雜合突變(表1)。在6例基因檢測陰性患兒中，1例面部發(fā)育異常提示綜合征型耳聾。根據(jù)家長要求，對1例GJB2基因299_300delAT雜合突變且聽力診斷為雙耳輕度聽力損失患者進行基因組測序檢查發(fā)現(xiàn), 其攜帶257C>G突變，為復合雜合突變，明確了遺傳學病因。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)65%的耳聾是由遺傳引起的[1]。新生兒聽力篩查經過多年發(fā)展，已經比較成熟，但是，新生兒聽力篩查有一定局限性，遲發(fā)性耳聾及藥物性耳聾患者均可通過新生兒聽力篩查。70%的遺傳性耳聾是以耳聾為唯一癥狀而不伴有其他臨床表現(xiàn)[6],耳聾基因診斷則有助于判別是否為遺傳導致的耳聾[7]。

從文中結果看，山東省9 147例新生兒耳聾基因攜帶率為5.04%，以GJB2和SLC26A4基因突變?yōu)橹?，攜帶率分別為2.45%和2.03%,GJB3和線粒體DNA12SrRNA基因突變攜帶率分別為0.30%和0.21%，其中GJB2、GJB3和線粒體DNA12SrRNA基因突變攜帶率與王秋菊等[2]的研究結果基本一致，只有SLC26A4結果略有不同?？偨Y可能有兩方面原因，一是本研究使用芯片在SLC26A4位點上比之前的研究多了6個位點，有利于發(fā)現(xiàn)更多突變個體；二是我國地域廣闊，各個地區(qū)之間耳聾基因突變的分布頻率可能存在一定差異。

在我國人群中，GJB2基因是引起遺傳性耳聾最常見的耳聾基因[1]。GJB2基因編碼的連接蛋白，主要參與細胞間信號介導和離子的傳遞[8]，其表達或者功能的異常會影響細胞間隙的連接功能，影響內耳鉀離子的正常回收而致聾；其遺傳方式表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，235delC突變在聽力正常人群中攜帶率為1%～2%[9]。本組新生兒GJB2基因突變發(fā)生率最高，攜帶率為2.45%，其中有164例為235delC雜合突變，攜帶率達1.79%，此結果與文獻報道相一致。本次篩查中發(fā)現(xiàn)2例GJB2純合突變和1例GJB2復合雜合突變的新生兒，這3例聽力初篩及復篩均顯示為“未通過”或“轉診”，聽力診斷2例為極重度聽力損失，1例為重度聽力損失。另外，還發(fā)現(xiàn)1例299_300delAT雜合突變者，雙耳為輕度聽力損失，對該例新生兒進行GJB2全序列測序，發(fā)現(xiàn)同時攜帶257C>G突變，是復合雜合突變，明確了遺傳學病因[10]，故建議其盡早進行聽力干預并長期隨診。研究報道，有50%以上的極重度耳聾患者在3月齡時具有正常的聽覺行為，至少20%在6個月時仍具有聽覺行為[11]。因此，上述病例需進行隨訪，追蹤其聽力變化情況，以免延誤治療和干預。

SLC26A4基因又稱PDS基因，位于人類染色體7q31，含21個外顯子，是大前庭水管綜合征的主要致病基因，其編碼的Pendred蛋白為離子轉運體，主要由疏水性氨基酸組成，其功能主要參與碘/氯離子等陰離子的轉運[12]。SLC26A4基因是僅次于GJB2突變而引起感音神經性聾的遺傳學病因，遺傳方式為常染色體隱性遺傳[13]。本組9 147例新生兒中SLC26A4基因攜帶者186例，其中發(fā)現(xiàn)1例IVS7-2A>G/2168A>G復合雜合突變患者，雙耳均通過聽力篩查，召回其父母采血行耳聾基因檢測，結果顯示父母分別為IVS7-2A>G雜合突變攜帶者和2168A>G雜合突變攜帶者；該患兒于出生后6月齡時行聽力診斷，CT結果示其右耳前庭水管擴張，左耳正常，聽力診斷結果示左耳輕度聽力損失，右耳中度聽力損失，建議患兒及時佩戴助聽器，該夫婦再次生育時應進行產前診斷。研究發(fā)現(xiàn)單純IVS7-2A>G雜合突變也有導致中度語后聾和重度語前聾的報道，很可能是SLC26A4基因上的第二個突變位點沒有被發(fā)現(xiàn)[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)4例SLC26A4雜合突變個體同樣存在雙側或單側的聽力損失，后期通過影像學診斷發(fā)現(xiàn)全部為大前庭水管綜合征，將在后續(xù)的研究中對這些患兒進行SLC26A4基因全基因測序分析，找到第二個可能的突變位點。

SLC26A4基因又稱為“一巴掌打聾基因”。在患兒成長過程中，頭部運動、外力作用、巨大的聲響及感冒、擤鼻涕等因素都可能導致聽力障礙的發(fā)生。本次篩查中檢出的SLC26A4基因突變186例，攜帶率為2.03%，僅次于GJB2的突變攜帶率；其中SLC26A4基因IVS7-2A>G突變116人，占SLC26A4基因突變62.7%。除上述1例IVS7-2A>G/2168A>G復合雜合突變患者及4例攜帶SLC26A4致聾基因聽力篩查未通過者外，剩余181例SLC26A4基因攜帶者均建議其進行聽力診斷檢查或該基因全系列分析。通過基因檢測，對于已經確診的患兒不僅可以早期明確病因診斷，還可以針對性地給予聽力保健指導。同時有利于提醒聽力檢測通過而基因檢測未通過的新生兒家長關注小兒聽力變化，如果發(fā)現(xiàn)聽力損失應及早保護患兒的殘余聽力并給予早期干預。

mtDNA12SrRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，mtDNA12SrRNA基因1494C>T、1555A>G與藥物性聾有關[15],1555A>G、1494C>T兩個突變可以導致12SrRNA的構象改變，形成與氨基糖苷類抗生素作用的結合位點，進而導致聽毛細胞逐漸凋亡引起永久性不可逆的耳聾。本研究在山東地區(qū)9 147例新生兒標本中發(fā)現(xiàn)mtDNA12SrRNA突變患者19例，均通過聽力診斷，在檢出結果后及時對該基因突變患者及其母系家庭成員的臨床用藥進行宣教，要求在后續(xù)的生活中禁止使用耳毒性藥物以防“一針致聾”。通過本次篩查可避免19位聽障患兒的產生，同時對家系成員進行用藥指導，避免后代產生聽力殘疾患者。

GJB3基因最初被發(fā)現(xiàn)在中國患者中導致常染色體顯性遺傳非綜合征型聾。2013年我國學者首次報道了新生兒中該基因的篩查結果[16]，目前認為該基因突變攜帶者可能為遲發(fā)性耳聾患者，雖然在新生兒期無耳聾癥狀，但應密切關注其聽力狀況。本研究發(fā)現(xiàn)27例為GJB3基因538C>T雜合突變，其聽力篩查結果正常，建議定期隨訪。

本研究結果表明，新生兒聽力篩查聯(lián)合耳聾基因篩查是大勢所趨，通過基因篩查可以早期發(fā)現(xiàn)部分聽力篩查不能發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性耳聾個體和藥物性耳聾個體及家系，擴大干預范圍，同時能夠依據(jù)發(fā)現(xiàn)的遺傳信息進行婚育指導，使防聾時間關口前移。目前，對新生兒耳聾基因篩查和聽力篩查的宣傳教育還是集中于醫(yī)療機構[17],經由醫(yī)務人員對家長進行宣教，尚不夠普及，效果受限。因此，殘疾人服務機構更應該加入到殘疾預防的行列中，積極通過多渠道提高本地區(qū)家長對遺傳性耳聾的認識，科學的理解遺傳性聾的發(fā)病原因，避免因為認識不足造成的延誤診斷，科學的面對聽力殘疾預防及殘疾康復。