玻璃化凍融卵裂期胚胎的保存時(shí)間對(duì)復(fù)蘇后結(jié)局的影響

冼卓杰，池霖生，黃建洲，朱 莉，李小琴

(佛山市婦幼保健院，廣東 佛山 528000)

1983年，Trounson和Mohry采用DMSO作為冷凍保護(hù)劑成功復(fù)蘇了一枚人類(lèi)胚胎，并移植后獲得了妊娠。1999年～2005年，Kuwayama、Isachenko、El Danasouri、Lane等分別對(duì)人類(lèi)卵母細(xì)胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷凍方法進(jìn)行了成功的嘗試[1]，成為目前采用的各期配子和胚胎玻璃化冷凍方法的基礎(chǔ)。目前玻璃化凍融方式較程序化凍融胚胎復(fù)蘇率高[2]，但玻璃化冷凍實(shí)際中的冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)對(duì)胚胎有一定的毒性，胚胎長(zhǎng)期保存后其安全性仍需進(jìn)一步研究。筆者對(duì)行激素替代周期(HRT)凍融卵裂期胚胎移植的947個(gè)周期的資料進(jìn)行回顧性分析，探討冷凍胚胎保存時(shí)間對(duì)卵裂期胚胎的凍融復(fù)蘇效果的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象：對(duì)2017年7月～2019年6月在我中心進(jìn)行玻璃化凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)947個(gè)周期的資料進(jìn)行回顧性分析，女方年齡20～44歲，平均(31.92±4.27)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩鼗蚰行砸蛩兀遗铰殉矁?chǔ)備功能正常，促排方案為長(zhǎng)方案與超長(zhǎng)方案所獲的玻璃化冷凍胚胎，解凍移植周期內(nèi)膜準(zhǔn)備采取HRT方案。排除因素：患子宮內(nèi)膜異位癥與干擾胚胎著床疾病的患者；解凍胚胎移植周期失敗超過(guò)2次的患者。根據(jù)卵裂期胚胎冷凍保存時(shí)間分為四組，凍存≤120 d(294個(gè)周期)為≤120 d組，凍存121～240 d(384個(gè)周期)為121～240 d組，凍存241～365 d(105個(gè)周期)為241～365 d組，凍存>365 d為>365 d組(164個(gè)周期)。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2研究方法：促排方案為長(zhǎng)方案和超長(zhǎng)方案，方案的選擇，胚胎冷凍及解凍、胚胎移植等按照本中心的常規(guī)程序進(jìn)行。胚胎玻璃化冷凍方法：冷凍試劑ES、VS室溫平衡30 min后，將D3胚胎置于ES中平衡6 min，待其形態(tài)恢復(fù)后，在VS中沖洗數(shù)次，胚胎裝入載桿，迅速投入液氮，胚胎在VS中的時(shí)間到投入液氮整個(gè)過(guò)程時(shí)間≤1 min。胚胎玻璃化解凍方法：解凍試劑包括WS1、WS2、WS3及WS4四種液體，提前30 min取出1 ml WS1倒入雙凹皿中并置于無(wú)CO2、37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫，其余三種液體分別置于室溫下四孔板中復(fù)溫。解凍時(shí)，快速將含胚胎載桿段浸入37℃的WS1中，輕晃使胚胎落下，37℃放置1 min，隨后依次在WS2平衡3 min、在WS3中平衡5 min、在WS4平衡1 min，最后將胚胎轉(zhuǎn)入6% CO2過(guò)夜平衡的G-2-PLUS培養(yǎng)液中進(jìn)行胚胎評(píng)分后放置于37℃、6% CO2的培養(yǎng)箱中。移植前30 min將G-2-PLUS內(nèi)的解凍胚胎轉(zhuǎn)移至EmbryoGlue中。[3]

1.3胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]：本中心主要根據(jù)卵裂球數(shù)目、均一性及碎片率進(jìn)行評(píng)分。記錄卵裂球個(gè)數(shù)；均一性分3級(jí)(Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則；Ⅱ級(jí)：大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則；Ⅲ級(jí)：大小明顯不均，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則)；碎片分4級(jí)(Ⅰ級(jí)：無(wú)碎片或碎片數(shù)量<5%；Ⅱ級(jí)：碎片數(shù)量<20%；Ⅲ級(jí)：碎片數(shù)量為20%～50%；Ⅳ級(jí)：碎片數(shù)量>50%)。D3優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：D3胚胎細(xì)胞數(shù)為7～9個(gè)，細(xì)胞均一性為Ⅰ～Ⅱ級(jí)，碎片Ⅰ～Ⅱ級(jí)。

1.4HRT方案：月經(jīng)第2～3天開(kāi)始口服戊酸雌二醇4 mg，1次/d，口服5～7 d；月經(jīng)第8～10天監(jiān)測(cè)卵巢、子宮內(nèi)膜厚度，增至口服戊酸雌二醇6 mg，1次/d，口服5～7 d。第13～15天監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，如果內(nèi)膜厚度<7 mm，雌激素以2 mg/d遞增，直至B超監(jiān)測(cè)下子宮內(nèi)膜≥7 mm后，血雌二醇>367 pmol/ml(100 pg/ml)、血P<3.12 nmol/ml時(shí)，給予黃體酮40～80 mg/d肌內(nèi)注射。開(kāi)始注射黃體酮當(dāng)日為第1天，第4天行卵裂期胚胎復(fù)蘇移植術(shù)。胚胎移植后第14天查血HCG，確定是否妊娠。如陽(yáng)性繼續(xù)用HCG或黃體酮至妊娠10～12周左右，胚胎移植28～35 d后行B超檢查，如妊娠囊中可探查到胎芽及搏動(dòng)的胎心則為臨床妊娠。

2 結(jié)果

2.1一般資料：四組患者各組之間女方年齡、解凍胚胎個(gè)數(shù)和平均移植胚胎個(gè)數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。>365 d組的女方年齡、解凍胚胎個(gè)數(shù)、平均移植胚胎個(gè)數(shù)均略高于其他三組。見(jiàn)表1。

表1 四組患者一般資料比較

2.2胚胎復(fù)蘇質(zhì)量比較：四組患者的卵裂期胚胎冷凍后，≤120 d組的解凍復(fù)蘇率為97.64%，完整復(fù)蘇率為95.79%，均略高于其余三組，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四組患者胚胎解凍復(fù)蘇情況[例(%)]

2.3復(fù)蘇胚胎移植后臨床結(jié)局比較：四組患者解凍后移植的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率和種植率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但>365 d組的臨床妊娠率和種植率較低，≤120 d組與121～240 d組的流產(chǎn)率較高。見(jiàn)表3。

表3 四組患者解凍移植后的臨床結(jié)局(%)

3 討論

現(xiàn)在全世界范圍內(nèi)的生殖中心廣泛采用胚胎和配子冷凍技術(shù)，使大量不育夫婦可以享受到天倫之樂(lè)。國(guó)內(nèi)現(xiàn)在使用范圍最廣的冷凍方法當(dāng)屬玻璃化冷凍法。玻璃化冷凍技術(shù)有著應(yīng)用范圍廣、復(fù)蘇存活率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效保存優(yōu)質(zhì)胚胎，提高每個(gè)促排卵周期的累積妊娠率，減輕患者經(jīng)濟(jì)與精神上的壓力[4-5]。

有研究[6]表明, 解凍后胚胎質(zhì)量對(duì)妊娠的成功率起主要作用，而冷凍的胚胎質(zhì)量直接影響著解凍后的臨床結(jié)局[7]。因此筆者回顧性分析了共947個(gè)凍融卵裂期胚胎解凍移植周期均通過(guò)長(zhǎng)方案和超長(zhǎng)方案進(jìn)行促排，HRT方案進(jìn)行解凍周期，盡量排除不同方案造成的差異。2010年Wirleitner B指出，胚胎冷凍時(shí)間的長(zhǎng)短并不影響胚胎復(fù)蘇后的存活率、著床率、妊娠率[8]。2014年我國(guó)的一項(xiàng)回顧性分析[9]得出相同的觀點(diǎn)。本研究中四組的存活率、著床率和妊娠率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Balaban B等指出,胚胎解凍后的復(fù)蘇情況對(duì)妊娠率有著顯著的影響[10]。本次研究中，>365 d組的解凍復(fù)蘇率、完整復(fù)蘇率和臨床妊娠率均為四組中最低，一定程度上驗(yàn)證了前面的觀點(diǎn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

雖然目前的大樣本人群研究指出胚胎冷凍保存時(shí)間在6年內(nèi)不會(huì)影響凍融胚胎的著床率、妊娠率及子代的出生缺陷率，但是今年來(lái)也有學(xué)者提出胚胎的冷凍保存可能會(huì)影響基因的穩(wěn)定性，造成胚胎DNA碎片的增加、線(xiàn)粒體DNA的突變等[11]。盡管世界各地相繼報(bào)道了許多長(zhǎng)時(shí)間冷凍后，成功妊娠并分娩健康嬰兒的案例，最長(zhǎng)為冷凍胚胎保存了25年。但胚胎冷凍保存時(shí)間超過(guò)10年以上的活產(chǎn)均為個(gè)案報(bào)道，目前仍然缺乏大樣本的研究。長(zhǎng)期胚胎冷凍保存時(shí)間對(duì)FET子代安全性的影響尚不明確[12]。

綜上所述，胚胎冷凍的時(shí)長(zhǎng)不會(huì)影響凍融胚胎解凍的臨床結(jié)局。但長(zhǎng)期冷凍保存的胚胎對(duì)子代安全性的影響尚不明確。