金黃色葡萄球菌coa和saeRS基因對小鼠部分生物學指標的影響

劉 影，郭海勇，計銀鐸

(1.上海農林職業(yè)技術學院，上海201699；2.吉林師范大學生命科學學院，吉林 四平136000；3.明尼蘇達大學 雙城校區(qū)獸醫(yī)學院，美國 明尼蘇達州55108)

金黃色葡萄球菌是人和動物的一種重要致病菌，能引起各種感染，包括皮膚、軟組織感染及全身感染，也是引起牛、羊乳房炎的重要病原菌之一。金黃色葡萄球菌的致病性主要歸因于細菌產生的各種毒性因子，使細菌逃避機體的免疫系統(tǒng)而引發(fā)疾病[1-3]，而金黃色葡萄球菌的雙組份信號轉導系統(tǒng)saeRS是毒性因子的重要調節(jié)系統(tǒng)[4]，增強毒性因子hla(α毒素基因)、hlb(β溶血素基因)、hlgabc(γ溶血素基因)、lukED(殺白細胞素基因)和coa(血漿凝固酶基因)的轉錄和表達[5-7]。金黃色葡萄球菌毒素可損傷乳房上皮細胞[8]，促使牛、羊乳房炎發(fā)生。IL-17是一種刺激和介導機體產生炎性反應的信號分子，誘導炎性因子產生[9]、粒細胞生成和抵御細菌感染[10-12]，也是機體皮膚和粘膜抵御感染的免疫分子[13]。研究表明,IL-17在機體抵御金黃色葡萄球菌感染過程中起到關鍵性作用[14]。因此，試驗旨在利用金黃色葡萄球菌saeRS及其相關基因coa突變菌株研究saeRS和coa基因對機體產生IL-17a的影響，探索金黃色葡萄球菌的致病機制，為臨床預防和治療牛、羊乳房炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試驗動物 金黃色葡萄球菌923(CA-MRSA)及其突變菌株923/coa、923/saeRS和923/coa/seaRS,各突變菌株特點如下：923/coa為敲除coa(血漿凝固酶)基因的菌株；923/saeRS為敲除saeRS(雙組分信號轉導系統(tǒng))基因的菌株；923/coa/saeRS為敲除coa(凝血酶)和saeRS基因的菌株；Balb/c 雌性小鼠(上海吉輝試驗動物飼養(yǎng)有限公司)，體重15～18 g。

1.1.2 主要試劑 IL-17a ELISA 檢測試劑盒(Raybiotech)。

1.1.3 主要儀器與設施設備 SPF動物房及隔離包(上海農林職業(yè)技術學院SPF)，分光光度計(T-6 北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)管理 小鼠飼養(yǎng)于SPF實驗動物房，溫度為25 ℃，12 h光照，自由采食和飲水。購入小鼠4 d后開始動物試驗，試驗期間每天固定時間稱量體重，測量皮膚傷口面積，測量方法為：游標卡尺測量傷口的長度和寬度，長度乘以寬度計算出傷口面積。

1.2.2 細菌接種方法 細菌劃線接種于TSA平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單個菌落接種5 mL TSB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。翌日按1:100比例轉接至 TSB培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。吸取1 mL細菌懸液于離心管中，離心，去除上清液，加入1mL PBS，吸打混勻，離心，去上清。再用PBS洗2次。細菌懸液用PBS稀釋至107個/mL。小鼠隨機分組，每組10只小鼠，背部剃毛、消毒，每只小鼠背部皮內注射100 μL細菌懸液。

1.2.3 血清制備和IL-17a檢測方法 每天測量小鼠體重及背部形成傷疤面積。分別于感染后8 h、24 h、72 h和120 h摘眼球法采血，制備血清。按照Raybiotech公司提供的IL-17a ELISA檢測方法檢測小鼠血清IL-17a。

1.2.4 皮膚內細菌數(shù)測定 無菌條件下取細菌感染部位皮膚，稱重，勻漿，PBS稀釋104倍，涂布TSA平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日菌落計數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計方法 用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行單因方差分析和Duncan法進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。用數(shù)據統(tǒng)計軟件SPSS 16.0 進行Pearson雙尾相關性分析。

2 結 果

2.1 小鼠體重

小鼠經背部皮內感染菌株923及其各突變菌株8 h、24 h、72 h和120 h后，各組體重如圖1所示。

感染細菌8 h后，923/coa/saeRS菌株感染組小鼠體重顯著高于923/coa菌株感染組小鼠體重(P<0.05)；感染細菌24 h和72 h后，923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組小鼠體重極顯著高于923/coa菌株感染組小鼠體重(P<0.01)；感染細菌120 h后，923/coa/saeRS菌株感染組小鼠體重極顯著高于923/saeRS菌株感染組小鼠體重(P<0.01)。

2.2 小鼠血清中IL-17a濃度

小鼠皮內感染細菌后8 h、24 h、72 h及120 h小鼠血清IL-17a濃度見圖2。

小鼠皮內細菌感染后，每個試驗組血清中IL-17a濃度逐漸升高，在24 h達到峰值，隨后濃度逐漸下降。感染后8 h，野生型菌株923組小鼠血清IL-17a濃度低于突變菌株923/saeRS組小鼠血清IL-

17a的濃度，其中菌株923組和923/saeRS組之間的IL-17a濃度差異達到統(tǒng)計學顯著(P<0.05)水平。感染后24～120 h，各試驗組間小鼠血清IL-17a濃度無顯著差異。

2.3 小鼠感染部位皮內細菌數(shù)

小鼠背部皮內感染菌株923及其各突變菌株72 h和120 h后，各組小鼠每克皮膚內細菌數(shù)如圖3所示。

感染后72 h,923菌株感染組小鼠每克感染部位皮膚內細菌數(shù)極顯著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組(P<0.01)。感染后120 h,923菌株感染組小鼠每克感染部位皮膚內細菌數(shù)顯著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組(P<0.05)。

2.4 小鼠細菌感染部位傷疤面積

從圖4可以看出，感染后8 h，各組小鼠在感染部位均未產生可測量傷疤。感染后24 h野生型菌株923組小鼠的傷疤面積顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積(P<0.05)；感染后72 h和120 h，野生型菌株923和突變菌株923/coa組小鼠的傷疤面積極顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積(P<0.01)。

2.5 血清IL-17a濃度與傷口面積的相關系數(shù)

各時間點血清IL-17a濃度與傷口面積間的皮爾遜相關系數(shù)見表1。由表1可以看出，感染后24 h血清IL-17a的濃度與感染后120 h小鼠感染部位傷疤面積的相關系數(shù)較強，并且達到極顯著水平(P<0.01)。

表1 血清IL-17a濃度與傷口面積的皮爾遜相關系數(shù)Table 1 Correlation coefficient of IL-17a concentrationsand skin lesion size

3 討 論

3.1 小鼠體重

從試驗結果可以看出，突變菌株923/coa/saeRS感染組體重極顯著高于923/coa和923/saeRS菌株感染組，923/saeRS菌株感染組小鼠體重極顯著高于923/coa菌株感染組，說明突變菌株923/coa/saeRS的毒性低于923/coa和923/saeRS菌株，菌株923/saeRS的毒性低于923/coa菌株，這可能與saeRS基因控制較多毒性因子的表達有關[5-7]。

3.2 小鼠感染部位皮膚內細菌數(shù)

感染細菌后的第3天和第5天，小鼠每克感染部位皮膚內細菌數(shù)，923菌株感染組分別極顯著和顯著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組，這可能是由于菌株923產生的毒性因子多于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株，造成菌株923逃避機體免疫系統(tǒng)的能力最強，而923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株毒性減弱[1-3]，因此923菌株在感染部位的細菌數(shù)最多，923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株在感染部位的細菌數(shù)減少。

3.3 小鼠血清中IL-17a濃度

感染后8 h，野生型菌株923組小鼠血清IL-17a濃度顯著低于突變菌株923/saeRS組，這可能與923菌株產生的血漿凝固酶引發(fā)感染部位產生凝血，抑制細菌向周圍擴散，從而降低感染初期血清IL-17a的濃度。

3.4 小鼠細菌感染部位傷疤面積

感染后8 h，各組小鼠在感染部位均未產生可測量傷疤。感染后24 h野生型菌株923組小鼠的傷疤面積顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積；感染后72 h和120 h，野生型菌株923和突變菌株923/coa組小鼠的傷疤面積極顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積。上述試驗現(xiàn)象可能與923/saeRS和 923/coa/saeRS菌株的毒力較弱，產生的毒素減少，免疫細胞產生的IL-17a也較少，不能有效介導機體的炎性反應，而很快被機體清除有關。突變菌株923/coa葡萄球菌血漿凝固酶直接受SaeRS調控[15]，野生型菌株923產生的血漿凝固酶，將無活性的凝血酶原轉變?yōu)橛谢钚缘哪?，凝血后可以保護細菌不被免疫細胞吞噬，并形成免疫逃逸[1-16]，而且金黃色葡萄球菌還能產生抑制嗜中性粒細胞富集和吞噬功能的分子[2]，抑制炎性反應，所以在感染部位形成的傷疤面積小于923/coa感染組，血清IL-17a的濃度也低于923/coa感染組。

3.5 血清IL-17a濃度與傷口面積的相關系數(shù)

感染后24 h血清IL-17a的濃度與感染后120 h小鼠感染部位傷疤面積呈較強的正相關，因此，感染后24 h血清IL-17a濃度可作為檢測和治療金黃色葡萄球菌感染的參考指標。

4 結 論

Coa和saeRS基因影響菌株923的毒性，從而影響被感染小鼠體重、感染部位細菌含量、感染部位皮膚傷疤面積和血清IL-17a濃度。