宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)生長(zhǎng)豬腸道形態(tài)、消化吸收功能及抗氧化能力的影響

陳亞楠, 張玉瑩, 張 昊,程 康,李思勉,張莉莉,王 恬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)是指哺乳動(dòng)物胎兒及其器官在子宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育受阻的現(xiàn)象，它的發(fā)生增加了胎兒圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率，是困擾人類醫(yī)學(xué)和動(dòng)物生產(chǎn)的一大難題[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮胎盤功能不全、宮內(nèi)感染、遺傳缺陷、環(huán)境應(yīng)激等因素均可誘導(dǎo)IUGR的發(fā)生[3]。流行病學(xué)調(diào)查表明，IUGR不僅導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受阻，還會(huì)引發(fā)動(dòng)物出生后期的代謝程序化，大大增加了胰島素抵抗、II型糖尿病、肥胖癥等代謝疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。在生產(chǎn)中，豬是最易發(fā)生IUGR的多胎家畜[3]。除上述因素外，子宮容積不足和母體營(yíng)養(yǎng)不良也是導(dǎo)致仔豬發(fā)生IUGR的兩個(gè)主要原因[3]。不僅如此，對(duì)高窩產(chǎn)仔數(shù)的不斷追求與初產(chǎn)母豬的提前配種進(jìn)一步加劇了IUGR現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致IUGR仔豬的自然發(fā)生率高達(dá)15%～20%[3]。因此，IUGR嚴(yán)重影響了動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育與健康狀況，給中國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失[2]。

腸道不僅是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝的主要場(chǎng)所，也是防御外界有害物質(zhì)(如抗原、毒素、氧化劑和病原體等)入侵的第一道屏障，其健康與否對(duì)于仔豬的正常發(fā)育具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，IUGR仔豬腸道功能損傷明顯，表現(xiàn)為絨毛萎縮、消化吸收能力較差、氧化應(yīng)激程度偏高、免疫功能受損及代謝失調(diào)等[7-9]。然而，目前業(yè)內(nèi)學(xué)者多以IUGR新生仔豬或斷奶仔豬為研究對(duì)象，往往忽略了其在生長(zhǎng)階段的腸道健康狀況。尤其是IUGR仔豬在生長(zhǎng)育肥期易發(fā)生追趕生長(zhǎng)，且伴隨機(jī)體對(duì)養(yǎng)分利用效率及物質(zhì)代謝特點(diǎn)的潛在轉(zhuǎn)變[10]。因而，研究IUGR仔豬在生長(zhǎng)階段的腸道發(fā)育水平與消化吸收特點(diǎn)，對(duì)深入了解追趕生長(zhǎng)的發(fā)生機(jī)制、完善飼養(yǎng)全程的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控策略均具有重要意義。因此，本研究以IUGR生長(zhǎng)豬為試驗(yàn)動(dòng)物，旨在探討IUGR對(duì)其腸道形態(tài)、消化吸收功能和抗氧化能力的影響，為隨后IUGR生長(zhǎng)豬的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧

選擇體況相似、胎次和預(yù)產(chǎn)期相近的妊娠母豬96頭，母豬分娩時(shí)，保留窩產(chǎn)仔數(shù)為10～13頭的杜×長(zhǎng)×大新生仔豬30窩，每窩選擇1頭正常初生重(normal birth weight,NBW)和1頭IUGR雄性仔豬。NBW新生仔豬的初生重介于群體平均初生重的0.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以內(nèi)，IUGR新生仔豬初生重低于群體平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[11]。仔豬斷奶前自由哺乳至21日齡，斷奶后分為NBW組和IUGR組，每組6重復(fù)，每重復(fù)5頭仔豬。所有仔豬斷奶后飼喂相同的商品日糧至90日齡，日糧配制參考美國(guó)NRC(2012)[12]，其配方和營(yíng)養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)期間自由采食、飲水，日常管理、消毒和免疫程序按照豬場(chǎng)常規(guī)流程執(zhí)行。

表1 日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the diets

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)選擇1頭仔豬進(jìn)行采樣。電擊致暈，放血致死，迅速剖開腹腔，分離空腸和回腸。分別在每段腸道中間部位截取長(zhǎng)度為1.0 cm的腸段，置于4%多聚甲醛溶液，固定后用于制備石蠟切片。采集大約2 g空腸和回腸食糜，置于凍存管中，使用液氮速凍后放于-80 ℃冰箱中保存。另外，使用手術(shù)剪剪開腸道，用無菌載玻片輕輕刮取腸道黏膜1.2～1.5 g，裝入凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 腸道組織形態(tài)觀察 腸道組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，采用普通石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為5 μm。腸道切片經(jīng)脫蠟和復(fù)水后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，所用試劑購自南京建成生物研究所，染色步驟按說明書嚴(yán)格執(zhí)行。使用Nikon ECLIPSE 80i光學(xué)顯微鏡對(duì)組織切片進(jìn)行觀察拍照。每張切片隨機(jī)選擇20個(gè)視野，用于測(cè)量絨毛高度(villus height,VH)、隱窩深度(crypt depth,CD)、絨毛寬度(villus width,VW)，計(jì)算絨毛高度/隱窩深度比(villus height: crypt depth ratio,VCR)，并按下列公式計(jì)算絨毛表面積(villus surface area,VSA)：

1.3.2 腸道食糜消化酶測(cè)定 使用生理鹽水將空腸和回腸食糜制備成20%稀釋液，借助高速勻漿機(jī)使其充分混勻，隨后于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，分離上清液用于測(cè)定脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶活力。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測(cè)定步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 腸道黏膜相關(guān)酶測(cè)定 取大約0.3 g空腸、回腸黏膜，經(jīng)4倍體積生理鹽水稀釋后，使用高速勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿。隨后于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，分離上清液用于測(cè)定二糖酶、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Na+/K+-ATP酶、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)活性，總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。上述指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.4 腸道黏膜基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè) 取空腸、回腸黏膜大約80 mg，使用Trizol試劑提取組織總RNA。樣品經(jīng)濃度、純度及完整性檢測(cè)合格后，采用大連寶生物Prime-ScriptTM試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，單鏈DNA(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)置于-20 ℃冰箱中保存。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)腸道基因鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(sodium/glucose cotransporter 1,SGLT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(glucose transporter 2,GLUT2)、脂肪酸結(jié)合蛋白3(fatty acid binding protein 3,FABP3)、小腸脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(peptide transporter 1,PEPT1)、陽離子氨基酸運(yùn)載體1(cationic amino acid transporter 1,CAT1)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)、谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1)和肌動(dòng)蛋白(β-actin)的mRNA表達(dá)豐度。使用NCBI Primer-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)特異性上、下游引物，經(jīng)GenBank Blast進(jìn)行同源性檢索合格后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及參數(shù)見表2。使用大連寶生物SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：在95 ℃下預(yù)變性30 s，在95 ℃下變性5 s，在60 ℃下退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析條件按系統(tǒng)推薦設(shè)置。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT方法對(duì)目的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

表2 qRT-PCR所用引物信息Table 2 Information regarding the primers used in qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道形態(tài)的影響

由表3可見，與NBW組相比，IUGR組空腸VSA和回腸VH顯著降低(P<0.05)，空腸VH和回腸VSA均有降低趨勢(shì)。兩組之間空腸、回腸VW、CD和VCR均無顯著差異(P>0.05)。

表3 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道形態(tài)的影響Table 3 Effect of IUGR on intestinal morphology of growing pigs at 90 days of age

2.2 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道食糜消化酶活性的影響

由表4可見，與NBW組相比，IUGR導(dǎo)致90日齡生長(zhǎng)豬空腸食糜脂肪酶活性顯著降低(P<0.05)。同時(shí)，IUGR組回腸食糜脂肪酶活性較NBW組有下降趨勢(shì)。此外，IUGR對(duì)生長(zhǎng)豬空腸和回腸食糜淀粉酶、胰蛋白酶活性均無明顯影響(P>0.05)。

表4 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道食糜消化酶的影響Table 4 Effect of IUGR on digestive enzyme activities in the intestinal contents of growing pigs at 90 days of age

2.3 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道黏膜二糖酶和代謝酶活性的影響

由表5可見，IUGR生長(zhǎng)豬在90日齡時(shí)空腸黏膜麥芽糖酶、回腸黏膜蔗糖酶、ALP和Na+/K+-ATP酶活性均較NBW生長(zhǎng)豬顯著降低(P<0.05)，空腸黏膜Na+/K+-ATP酶活性較NBW生長(zhǎng)豬有下降的趨勢(shì)。而空腸黏膜蔗糖酶、乳糖酶和ALP，回腸黏膜麥芽糖酶和乳糖酶活性在兩組之間均沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬黏膜消化吸收功能的影響Table 5 Effect of IUGR on digestive and absorptive function in mucosa of growing pigs at 90 days of age

2.4 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道氧化還原狀態(tài)的影響

與NBW組相比，IUGR導(dǎo)致生長(zhǎng)豬90日齡時(shí)空腸、回腸黏膜T-SOD活性顯著下降，空腸黏膜MDA含量顯著升高(P<0.05)。兩組之間空腸、回腸黏膜T-AOC和GPX活性及回腸黏膜MDA含量沒有顯著差異(P>0.05)。

表6 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道氧化還原狀態(tài)的影響Table 6 Effect of IUGR on redox status of intestine of growing pigs at 90 days of age

2.5 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道功能相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

由表7可見，IUGR顯著降低了90日齡生長(zhǎng)豬空腸和回腸黏膜SGLT1、SOD2以及空腸黏膜SOD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，且有抑制空腸黏膜GLUT2和I-FABP轉(zhuǎn)錄的趨勢(shì)。此外，與NBW組相比，IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬空腸黏膜FABP3、PEPT1、CAT1、GPX1以及回腸黏膜GLUT2、FABP3、I-FABP、PEPT1、CAT1、SOD1、GPX1的轉(zhuǎn)錄水平均無明顯改變(P>0.05)。

表7 IUGR對(duì)90日齡生長(zhǎng)豬腸道功能相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Table 7 Effect of IUGR on expression levels of genes related to intestinal function of growing pigs at 90 days of age

3 討 論

3.1 IUGR對(duì)生長(zhǎng)豬腸道形態(tài)的影響

腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝的重要器官，其形態(tài)和功能的完整性對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用至關(guān)重要。一般認(rèn)為，腸黏膜VH增加、VSA增大可使小腸上的轉(zhuǎn)運(yùn)載體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積增大，從而有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[13]。Dong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IUGR導(dǎo)致哺乳仔豬小腸絨毛受損明顯，呈現(xiàn)鋸齒狀且高度變短。Li等[15]研究結(jié)果也證實(shí)，IUGR斷奶仔豬空腸和回腸VH和VCR降低。這些研究均表明，IUGR可對(duì)仔豬出生后早期階段的腸道形態(tài)造成損傷。在本試驗(yàn)中，IUGR顯著降低了90日齡生長(zhǎng)豬的空腸VSA和回腸VH，提示IUGR損傷仔豬腸道形態(tài)的現(xiàn)象至少會(huì)持續(xù)至生長(zhǎng)階段。盡管此時(shí)IUGR豬腸道損傷程度與其新生或斷奶階段相比已得到一定改善，但鑒于腸道在養(yǎng)分利用及機(jī)體代謝中的重要作用，上述損傷對(duì)IUGR生長(zhǎng)豬發(fā)育水平和健康狀況仍具有不可忽視的負(fù)面影響[16]。

3.2 IUGR對(duì)生長(zhǎng)豬消化吸收功能的影響

脂肪、糖類和蛋白質(zhì)是機(jī)體的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們進(jìn)入小腸后，在一系列消化酶作用下被分解為氨基酸、小肽、單糖和脂肪酸，這些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體或以其他形式進(jìn)入細(xì)胞以供機(jī)體利用[17]。因此，腸道消化酶活性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的數(shù)量影響著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。有研究報(bào)道，IUGR限制了仔豬胃腸道生長(zhǎng)發(fā)育，降低了內(nèi)源消化酶的活性[18]。本試驗(yàn)中，IUGR顯著降低了90日齡生長(zhǎng)豬空腸食糜脂肪酶活性，并使回腸食糜脂肪酶活性和空腸黏膜I-FABPmRNA表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，這或與IUGR損傷生長(zhǎng)豬腸道代謝狀態(tài)的現(xiàn)象有關(guān)[19]。I-FABP是腸道脂肪酸結(jié)合蛋白，可催化腸道游離脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞，從而參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。本試驗(yàn)結(jié)果提示，在90日齡時(shí)IUGR生長(zhǎng)豬腸道仍存在脂肪消化不良及轉(zhuǎn)運(yùn)吸收功能受損的現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)，IUGR顯著降低了空腸和回腸SGLT1 mRNA表達(dá)水平，且有抑制空腸黏膜GLUT2轉(zhuǎn)錄表達(dá)的趨勢(shì)。SGLT1和GLUT2是腸黏膜中重要的糖類轉(zhuǎn)運(yùn)載體，多糖經(jīng)消化酶分解后轉(zhuǎn)變成單糖，單糖可在腸道黏膜刷狀緣與SGLT1結(jié)合，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞。另外，胞中的單糖也可同位于腸上皮基底中的GLUT2結(jié)合，經(jīng)易化擴(kuò)散進(jìn)入血液，供機(jī)體利用[20]。SGLT1生理功能的正常發(fā)揮需由Na+/K+-ATP酶提供能量。本研究發(fā)現(xiàn)，IUGR抑制了生長(zhǎng)豬空腸、回腸黏膜Na+/K+-ATP酶活性，這與黃強(qiáng)等[21]的研究結(jié)果基本一致。其研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶后早期階段IUGR仔豬空腸黏膜Na+/K+-ATP酶活性顯著低于NBW仔豬，SGLT1 mRNA表達(dá)水平亦有下調(diào)趨勢(shì)[21]。因而，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在90日齡時(shí)IUGR生長(zhǎng)豬腸道功能損傷依然明顯，對(duì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力不足的問題仍存在[22]。

二糖酶是反映腸道消化吸收能力的標(biāo)志性酶，是衡量腸道功能發(fā)育成熟的有力指標(biāo)[23]。諸多研究表明，IUGR改變了腸道二糖酶的發(fā)育模式。周根來等[24]研究發(fā)現(xiàn)，IUGR會(huì)阻礙新生仔豬小腸乳糖酶的成熟。Su等[25]的試驗(yàn)結(jié)果也表明，IUGR會(huì)顯著降低斷奶仔豬空腸黏膜麥芽糖酶和回腸黏膜蔗糖酶活性。在本試驗(yàn)條件下，IUGR豬在90日齡時(shí)其空腸黏膜麥芽糖酶和回腸黏膜蔗糖酶活性依然顯著低于NBW豬，提示此時(shí)IUGR豬的腸道發(fā)育依然滯后于NBW豬。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，IUGR生長(zhǎng)豬在90日齡時(shí)回腸ALP活性顯著下降。這與前人的研究結(jié)果相似，黃強(qiáng)等[21]和王遠(yuǎn)孝[16]研究表明，IUGR顯著降低了35和66日齡仔豬空腸黏膜ALP活性。ALP不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是一種內(nèi)源性解毒因子，可抵抗腸道內(nèi)致病菌分泌脂多糖，從而保護(hù)腸道健康[26]。上述結(jié)果表明，IUGR阻礙仔豬腸道發(fā)育的現(xiàn)象可持續(xù)至生長(zhǎng)期。因此，如何改善IUGR豬腸道的發(fā)育滯后是當(dāng)前生豬養(yǎng)殖所面臨的一項(xiàng)迫切的現(xiàn)實(shí)問題。

3.3 IUGR對(duì)生長(zhǎng)豬腸道氧化還原狀態(tài)的影響

健康狀態(tài)下，機(jī)體中的氧化和抗氧化系統(tǒng)處于某種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物超出其本身的清除能力時(shí)，容易發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激會(huì)破壞細(xì)胞及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致DNA損傷和脂質(zhì)過氧化，繼而引起細(xì)胞死亡、組織損傷乃至某些疾病的發(fā)生[27-28]。本試驗(yàn)中，IUGR導(dǎo)致90日齡生長(zhǎng)豬空腸黏膜MDA含量明顯升高。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，可反映機(jī)體氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷的程度[29]。因而，本研究結(jié)果表明，IUGR豬在生長(zhǎng)階段腸道依然存在氧化應(yīng)激程度偏高的現(xiàn)象，這可能與腸道黏膜T-SOD活性及SOD1、SOD2轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到抑制有關(guān)。SOD是動(dòng)物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，可抵抗自由基損傷，維持細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能。與此相似，Huang等[30]研究表明，在斷奶后早期階段IUGR會(huì)降低仔豬空腸黏膜T-SOD活性和T-AOC。Su等[25]也發(fā)現(xiàn)，IUGR導(dǎo)致斷奶仔豬空腸和回腸黏膜MDA含量顯著升高，而還原型/氧化型谷胱甘肽比例明顯下降?；谏鲜鲅芯浚覀兺茰y(cè)合理使用抗氧化劑對(duì)于改善IUGR豬出生后早期及生長(zhǎng)期的腸道氧化應(yīng)激或具有積極作用，但其效果仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，IUGR導(dǎo)致生長(zhǎng)豬腸道形態(tài)受損，腸道消化和代謝酶活性降低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)減少，并造成空腸黏膜脂質(zhì)過氧化水平升高，提示IUGR對(duì)仔豬腸道發(fā)育的不良影響至少會(huì)持續(xù)至其90日齡。上述結(jié)果可為酶制劑、抗氧化劑等營(yíng)養(yǎng)素在IUGR生長(zhǎng)豬上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。