甘露糖結(jié)合凝集素基因多態(tài)性及血清表達與慢性阻塞性肺疾病患者急性加重的相關(guān)性研究*

蘇日娜，李水霞，高 揚，張 毅，馬顯軍，孫麗蓉

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭 014030)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續(xù)氣流受限為特征的、可預(yù)防和治療的常見病，氣流受限呈進行性發(fā)展，與氣道和肺部對有害氣體或有害顆粒的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD患者平均每年會發(fā)生1～3.5次的急性加重[1]。每一次的急性加重將給患者的肺功能、社會及個人經(jīng)濟帶來嚴重的不良影響。據(jù)研究70 %的急性加重患者由感染引起。甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體，可通過結(jié)合暴露在侵入細菌表面的甘露糖而激活補體系統(tǒng)，具有促進調(diào)理吞噬、調(diào)節(jié)炎癥過程及啟動細胞凋亡等多種功能，能幫助機體防御抵抗多種病原微生物的感染[2-3]。MBL基因突變可干擾形成穩(wěn)定功能的蛋白多聚體，致體內(nèi)MBL血清水平下降，降低機體免疫防御和免疫監(jiān)視能力，增加人體對各種病原體感染的遺傳易感性，如MBL缺陷個體易患非囊性纖維化導(dǎo)致支氣管擴張，MBL水平低于200 ng/mL與肺部病理改變損傷程度、入院次數(shù)及疾病進展相關(guān)[4]。本研究通過了解COPD患者MBL基因多態(tài)性及其血清表達水平，探討MBL2第54位密碼子多態(tài)性是否會影響MBL水平、COPD急性加重及易感性，為COPD急性加重的防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1對象 納入內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科2013年1月至2014年12月住院診治的COPD患者63例(COPD組)，男38例、女25例，年齡(68.5±8.3)歲，均符合COPD診斷標準，處于穩(wěn)定期。其中COPD反復(fù)加重組30例、COPD非反復(fù)加重組33例。同期內(nèi)本院體檢健康者54例(對照組),男32例、女22例，年齡(65.9±7.7)歲。兩組年齡、性別比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有入組患者均了解本研究的目的和內(nèi)容，簽署知情同意書。

1.1.2診斷標準 COPD診斷標準參照2013年COPD診斷指南。COPD急性加重是指COPD患者的呼吸系統(tǒng)癥狀在短時內(nèi)惡化，需要改變?nèi)粘Ｖ委煼桨浮OPD反復(fù)加重即入選2年內(nèi)急性加重的次數(shù)≥2次，COPD非反復(fù)加重即入選2年內(nèi)急性加重次數(shù)<2次。

1.1.3排除標準 支氣管哮喘、支氣管擴張及矽肺等慢性呼吸系統(tǒng)疾病者，其他系統(tǒng)遺傳傾向病史的患者。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 血液基因組DNA抽提試劑盒、PCR引物、Taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶BshN Ⅰ、DNA Marker、MBL酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(生工生物工程股份有限公司)，PCR擴增儀PE480。

1.2.2標本采集及處理 使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetic acid，EDTA)抗凝管采集COPD穩(wěn)定期患者及健康者晨起空腹外周靜脈血3 mL，血液經(jīng)4 000 r/min離心取血清，標本保存于-70 ℃待測。

1.2.3聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR) 按試劑盒說明書進行。PCR引物的設(shè)計根據(jù)參考文獻[5]而合成(生工生物工程有限公司)。MBL-54上游引物：5′-GTAGGACAGAGGGCATGCTC-3′，下游引物：5′-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3′。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/μL上游引物2.0 μL，10 μmol/μL下游引物2.0 μL，DNA模板2.0 μL，蒸餾水19.0 μL。MBL2 PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min/1kb，延伸72 ℃ 7 min。MBL-54重復(fù)35個循環(huán),末次循環(huán)后再72 ℃延伸7 min，4 ℃存放備用。

1.2.4限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù) MBL2-54酶切反應(yīng)體系：滅菌去離子水18.0 μL，10×內(nèi)切酶緩沖液2.0 μL，PCR產(chǎn)物10.0 μL，內(nèi)切酶2.0 μL(BshN Ⅰ)，總體積32.0 μL。按上述順序?qū)⒏鞒煞址謩e加入到0.5 mL EP管中，瞬時離心；所有加樣過程均在冰盒上操作，以防止內(nèi)切酶活性降低；BshN Ⅰ內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件均為37 ℃，將各反應(yīng)管放EP管架上37 ℃電熱恒溫水槽中保溫6 h。酶切結(jié)果判斷：MBL2基因外顯子1區(qū)第54位密碼子PCR產(chǎn)物為329 bp的堿基片段，含A等位基因的片段包含限制性內(nèi)切酶BshN Ⅰ酶切位點，可被酶切為245 bp、84 bp兩個片段，含B等位基因的片段不能被酶切，顯示為329 bp一條帶，BB型為329 bp一條帶，AB型為329 bp、245 bp、84 bp三條帶，AA型為245 bp、84 bp兩條帶。

1.2.5血清MBL水平的測定 按試劑盒說明書操作，最后用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)，MBL濃度與OD450值之間呈正比關(guān)系，最后可通過繪標準曲線計算出樣品中的MBL水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料用(均數(shù)±標準差)表示，非正態(tài)分布的計量資料用百分位數(shù)(P25,P75)和極值(最大值和最小值)表示。組間基因型和等位基因在組內(nèi)構(gòu)成比的差別，采用卡方檢驗。組間血清MBL水平比較用秩和檢驗。COPD反復(fù)急性加重組與非反復(fù)急性加重組MBL基因型的關(guān)聯(lián)強度用Logistic回歸模型計算相對風(fēng)險度的比值比(OR)及95 %可信區(qū)間(CI)。所有分析均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 COPD組與對照組MBL2基因型及等位基因頻率分析

2.2COPD組與對照組MBL水平比較 COPD組MBL水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 COPD組與對照組血漿MBL水平比較(ng/mL)

2.3COPD組不同基因型的血清MBL水平分析 AB及BB基因型的MBL水平低于AA基因型。MBL2基因第54位密碼子多態(tài)性會導(dǎo)致血清MBL水平下降。見表3。

表3 63例COPD組患者不同基因型的血清MBL水平分析(ng/mL)

2.4COPD組不同基因型的COPD急性加重次數(shù)的比較 COPD反復(fù)加重組與非反復(fù)加重組兩組基因型分布、等位基因頻率在兩組間分布均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其中，B等位基因在COPD反復(fù)加重組的頻數(shù)高于COPD非反復(fù)加重組。另外，本研究發(fā)現(xiàn)MBL2基因第54位密碼子多態(tài)性與COPD急性加重相關(guān)，B等位基因及BB、AB型基因攜帶者COPD急性加重的可能性大。見表4和表5。

表4 COPD反復(fù)加重組與COPD非反復(fù)加重組MBL2基因型頻率分析

表5 COPD反復(fù)加重組與COPD非反復(fù)加重MBL2不同基因型相關(guān)分析

3 討論

COPD是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，COPD急性加重會加快肺功能下降速率，降低患者生命質(zhì)量，增加患者死亡率，給社會經(jīng)濟帶來負擔，感染是其主要原因。

人MBL基因位于第10號染色體，包括MBL1和MBL2兩個基因，其中MBL2基因有編碼功能。MBL2基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。MBL2啟動子區(qū)域-550、-221、+4位點和外顯子1區(qū)第52、54、57位密碼子共6個單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)以及由多個位點SNP組合而成的單體基因型是影響人MBL血清水平和功能的主要因素[6]。目前MBL2基因多態(tài)性研究較多的是SNP，外顯子1區(qū)的第52、54、57位點的多態(tài)性，分別以D、B、C(統(tǒng)稱為O)代表這3個位點突變的等位基因，對應(yīng)于正常型(A)。國外學(xué)者對第54位點多態(tài)性與疾病的關(guān)系研究較多，該位點是由甘氨酸被天冬氨酸替代所致，在健康人群中血清MBL的水平主要受它的多態(tài)性的影響。基因型不同，相應(yīng)的MBL表達水平也不相同。MBL正常功能與其血清表達水平密切相關(guān)，若血清MBL濃度過低，循環(huán)中的MBL分子多以單體形式存在，不能有效抵抗入侵的病原體，表現(xiàn)為不明原因的反復(fù)感染或感染的持續(xù)時間延長。不同的民族或人種中MBL基因各關(guān)鍵位點的SNP和常見基因型不同，不同的基因型血液循環(huán)中MBL水平差異大，從而造成不同人群對疾病易感性也不同。

研究表明，MBL2基因多態(tài)性會影響血清MBL水平，MBL2基因多態(tài)性與COPD發(fā)病相關(guān)[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古包頭地區(qū)漢族人存在MBL2基因第54位密碼子多態(tài)性，但COPD組和對照組基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示COPD患者與正常人群的MBL2基因第54位密碼子基因型無差異，也有可能是同一基因存在多位點多態(tài)性有相互調(diào)節(jié)作用，單個位點多態(tài)性影響作用小所導(dǎo)致的結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)，缺乏MBL將增加COPD、哮喘等疾病的易感性[8]，導(dǎo)致機體反復(fù)感染[9-10]。MBL缺乏還與中耳炎、肺炎及敗血癥等的易感性增加有關(guān)[11]。有研究卻發(fā)現(xiàn)MBL缺乏與COPD發(fā)病不存在相關(guān)性[12]，結(jié)論有爭議。本研究中COPD患者MBL水平低于對照組，低MBL水平有可能影響COPD發(fā)病。此外，本實驗中COPD組中AB、BB基因型血清MBL水平比AA基因型低，說明MBL2第54位密碼子基因多態(tài)性會降低血清MBL水平。

研究表明，由MBL2第54位密碼子的多態(tài)性引起的MBL缺乏與COPD患者急性加重住院有較強關(guān)聯(lián)。而Albert等[13]以反復(fù)急性加重的COPD患者為研究對象進行研究，發(fā)現(xiàn)只有1.9 %的患者MBL水平低于正常水平，且研究中沒有發(fā)現(xiàn)MBL水平與COPD急性加重頻率有相關(guān)性。這與Yang等[5]報道結(jié)果相反。本實驗發(fā)現(xiàn)COPD組中AB、BB基因型血清MBL水平比AA基因型低，MBL2多態(tài)性與COPD患者急性加重次數(shù)相關(guān)，AB、BB型基因攜帶者COPD急性加重頻率較AA型高，B等位基因可能是COPD急性加重的易感基因。本研究結(jié)果與Yang等[7]研究結(jié)果易感基因相同，與Albert等[13]研究結(jié)論不一致，這可能由種族及地區(qū)之間差異造成，也可能是抽樣誤差所致，可通過增加樣本量來減少誤差。本研究的樣本量較小，有待增大樣本量或進行多個SNP位點同時分析來完善研究結(jié)果，以探究COPD及COPD急性加重的發(fā)病機制。