Genistein通過JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成

李宸宇,孔 麗,王文娟,賀榮華,王永瑞,周國宏*

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院眼科,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)解剖教研室;3山西省眼科醫(yī)院淚道病科;4天津市兒童醫(yī)院眼科;5山西省眼科醫(yī)院急診科;*通訊作者,E-mail:guohongzhou2005@163.com)

視網(wǎng)膜新生血管性疾病是臨床上嚴(yán)重的致盲性眼病之一[1,2]。目前該類疾病的患病率呈逐年上升的態(tài)勢(shì),新生血管的形成是一項(xiàng)涉及多個(gè)機(jī)制、多個(gè)通路的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程,其中抗新生血管生成因子和促新生血管生成因子間的互相作用這一機(jī)制被廣泛認(rèn)可。既往針對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的治療方案通常為玻璃體切除術(shù)、視網(wǎng)膜激光光凝等,但不可否認(rèn)這些手段往往都伴隨著對(duì)組織不同程度的損害。隨著技術(shù)手段的不斷豐富,研究的目光逐漸集中到了選擇性分子靶向治療病理性血管形成方向,這也要求更加深入了解參與其形成的信號(hào)通路[3]。

JAK/STAT之所以被關(guān)注,是因?yàn)槠渥鳛橐环N重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,介導(dǎo)許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并參與多種細(xì)胞通路的調(diào)控,如細(xì)胞增殖、分化和凋亡[4]。該通路是由酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT三部分組成[5]。有研究認(rèn)為,JAK2/STAT1的激活將誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,而JAK2/STAT3的激活則可能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖[6],信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3(STAT3)蛋白對(duì)調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和血管的生成有非常重要的作用[7],在通過激光誘導(dǎo)制備脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的動(dòng)物模型中,STAT3的活化被認(rèn)為參與促進(jìn)了CNV的發(fā)展[8],STAT3的酪氨酸705位點(diǎn)被Janus激酶激活(JAK)如JAK2激活時(shí),可使STAT3二聚化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并引起各種生物反應(yīng)[9,10]。

Genistein為一種來源于大豆異黃酮的特異的酪氨酸酶抑制劑[11],是大豆異黃酮的主要成分[12],之前的研究顯示Genistein可以通過預(yù)防促炎因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能障礙,進(jìn)而調(diào)節(jié)血管炎癥發(fā)生的進(jìn)程,從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[13,14]。有研究[8,15]發(fā)現(xiàn)Genistein可保護(hù)和修復(fù)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,其作用可能與抗氧化、增強(qiáng)SOD活性有關(guān)。作為酪氨酸酶抑制劑,可以抑制酪氨酸酶所引起的受體磷酸化和有絲分裂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用[16,17]。

然而,關(guān)于Genistein是通過何種作用機(jī)制參與到抑制視網(wǎng)膜新生血管的過程中，這一問題尚未完全明確。Genistein在高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的模型中是否通過JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮作用?本研究旨在探討Genistein在視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的所發(fā)揮的作用以及JAK/STAT信號(hào)通路在其中扮演的角色，希望為視網(wǎng)膜新生血管的治療提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57BL/6J小鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,小鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格依照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。選取7日齡C57BL/6J健康小鼠36只,雌雄不限,體質(zhì)量在4.0-5.0 g之間,與其母鼠共同喂養(yǎng)。每日使用室內(nèi)日光燈照射持續(xù)12 h,且維持室內(nèi)環(huán)境溫度為(22±2)℃,濕度恒定于50%-60%之間。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組各9只,即18眼。

1.1.2 主要試劑和儀器 Geinstein(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(深圳市康初源有限公司);Trizol試劑(Sigma-Aldrich,美國);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(上海生工生物科技有限公司);RIPA裂解液(Sigma-Aldrich,美國);兔抗鼠JAK2抗體、兔抗鼠STAT3抗體、抗兔IgG二抗,β-actin多克隆抗體(Santa Cruz,美國);氧濃度檢測(cè)儀(青島科凱電子研究所有限公司);眼科手術(shù)顯微鏡(Leica,德國);熒光顯微鏡(Leica,德國);PCR儀(德國Eppendorf);多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型的建立 除了正常對(duì)照組在自然環(huán)境中飼養(yǎng),不予任何處理外,將其余三組7日齡小鼠與其母鼠于同一氧箱飼養(yǎng),密封氧箱的氧體積分?jǐn)?shù)被設(shè)定為(75±2)%,于5 d后打開氧箱,并返回到正常氧濃度環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)5 d,可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管的形成。

1.2.2 小鼠玻璃體腔注射 在小鼠出氧箱第5天(即出生第12天,P12)時(shí),實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的小鼠,參考賀榮華等[17]描述的方法,以5%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射(300 ml/kg體質(zhì)量),麻醉妥當(dāng)后置于手術(shù)顯微鏡下,于角膜緣后1 mm處垂直眼球進(jìn)針,使用微量注射泵行玻璃體腔藥物注射。予實(shí)驗(yàn)對(duì)照組注射DMSO 1 μl;予實(shí)驗(yàn)組注射溶于DMSO(400 mg/L)溶劑中的Genistein 1 μl;此兩組小鼠待麻醉劑失效后回歸鼠籠繼續(xù)同母鼠飼養(yǎng);正常對(duì)照組和模型組不予藥物處理。

1.2.3 視網(wǎng)膜熒光造影鋪片 按照以下配方配置視網(wǎng)膜熒光造影劑:將異硫氰酸葡聚醛熒光素(FITC-dextran,相對(duì)分子質(zhì)量2×106)50 mg,溶解于1 ml PBS緩沖液。分別隨機(jī)在4組P17小鼠中各取2只,用5%水合氯醛通過腹腔注射(300 ml/kg)的方法對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,麻醉妥當(dāng)后剪開其胸骨,將少量熒光素通過1 ml注射器注入小鼠左心室。注射完畢后立即摘取眼球并置于4%多聚甲醛避光固定3 h。手術(shù)顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜并鋪片,通過熒光顯微鏡觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.2.4 視網(wǎng)膜的剝離 第17天(即P17)時(shí)使用頸椎脫臼法處死其他小鼠,同前方法保留視網(wǎng)膜鋪片,置于Eppendorf管中。進(jìn)行real-time PCR、Western blot試驗(yàn)前保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.5 real-time PCR法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜JAK2和STAT3 mRNA水平 各組取P17小鼠4只,8眼行real-time PCR檢測(cè)JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達(dá),利用生工RNA提取試劑盒提取小鼠視網(wǎng)膜總RNA后,按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄條件:11 μl RNA(1 μg),隨機(jī)引物(0.2 μg/ml)1 μl,65 ℃孵育5 min;加入4 μl 5×Buffer,3 μl dNTP(10 mmol/L),1 μl RNA酶抑制劑(20 U/μl)和1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(20 U/μl),25 ℃孵育10 min、42 ℃孵育1 h、72 ℃孵育15 min,完成RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的過程。以cDNA為模板,分別對(duì)JAK2和STAT3進(jìn)行PCR。引物序列見表1。加入PCR反應(yīng)液,94 ℃預(yù)變性10 min,活化Tag酶;94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,45個(gè)循環(huán)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束后通過熔解曲線檢測(cè),確認(rèn)擴(kuò)增的特異性,根據(jù)各組組織中β-actin、JAK2和STAT3mRNA的Ct值,以2-ΔΔCt表示各組組織中JAK2和STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot法檢測(cè)JAK2和STAT3蛋白在小鼠視網(wǎng)膜的表達(dá) 各組取P17小鼠3只,6眼行Western blot法檢測(cè),用裂解液裂解小鼠視網(wǎng)膜,置于Eppendorf管中,超聲勻漿,10 000g,4 ℃離心10 min,取上清,蛋白定量。加入等體積的2×SDS buffer(Tris-Cl 100 mmol/L,DTT 200 mmol/L,甘油20%,溴酚藍(lán)0.2%,SDS 4%),95 ℃煮沸5 min,迅速冰浴,10 000g,4 ℃離心10 min,收集上清。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳法分離(JAK2 8%的分離膠,STAT3 15%的分離膠),電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%BSA溶液,4 ℃封閉3 h;分別加入兔抗鼠JAK2單克隆抗體或兔抗鼠STAT3單克隆抗體,4 ℃過夜孵育,洗滌,再加入抗兔IgG二抗,孵育,洗滌;ECL底物化學(xué)發(fā)光,顯影,定影,掃描。以β-actin為內(nèi)參。根據(jù)各組組織中β-actin、JAK2和STAT3蛋白印跡測(cè)定的光密度值,以JAK2/β-actin的比值和STAT3/β-actin比值表示各組組織中JAK2和STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜血管的形態(tài)

正常對(duì)照組視網(wǎng)膜血管走行自然、清晰,未見新生血管簇、血管滲漏和缺血無灌注區(qū);模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的視網(wǎng)膜血管可以觀察到明顯的新生血管簇,伴隨著血管走形紊亂,其間可見明顯的分支、分層現(xiàn)象;實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜新生血管簇較少,未見明顯的血管分層、分支現(xiàn)象,走形比較自然(見圖1)。

A.正常對(duì)照組 B.模型組 C.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 D.實(shí)驗(yàn)組圖1 熒光顯微鏡下各組小鼠視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)比較 (FITC-dextran,×50)Figure 1 Morphology of retinal neovascularization in each group under fluorescence microscope (FITC-dextran,×50)

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平的比較

各組視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(JAK2:F=26.92,P<0.001;STAT3:F=25.21,P<0.001),與正常對(duì)照組相比,模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3的mRNA的表達(dá)水平(2-ΔΔCt)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中JAK2和STAT3的mRNA的表達(dá)水平(2-ΔΔCt)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 各組JAK2和STAT3 mRNA水平的比較

2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平的比較

Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明,各組視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(JAK2:F=26.46,P<0.001;STAT3:F=16.10,P<0.001),與正常對(duì)照組相比,模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2,表3)。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量Figure 2 The expression levels of JAK2 and STAT3 proteins in the retinas of mice in each group by Western blot

表3 各組JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量的比較

3 討論

近年來,由病理性視網(wǎng)膜新生血管引起的眼部疾病在致盲性眼病中所占比例不斷上升,成為了導(dǎo)致各年齡段患者失明的主要原因,常見的視網(wǎng)膜新生血管眼病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞等。新生血管的生成,涉及到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和發(fā)芽[18],受到諸如細(xì)胞因子、黏附因子、蛋白酶等各種復(fù)雜信號(hào)通路的調(diào)控。一般認(rèn)為,在由前述疾病引起視網(wǎng)膜大面積的缺血、缺氧的環(huán)境下[19],視網(wǎng)膜出現(xiàn)了微循環(huán)障礙,打破了調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)的各類因子間的穩(wěn)態(tài)。這種失衡的結(jié)果表現(xiàn)為以VEGF為代表的促血管生長(zhǎng)因子的大量表達(dá),而新生血管由于自身發(fā)育的不完善,在生長(zhǎng)過程中可能會(huì)出現(xiàn)血管的滲漏和出血,進(jìn)而誘發(fā)視網(wǎng)膜脫離或玻璃體出血等嚴(yán)重并發(fā)癥,從而破壞了感光細(xì)胞和視力。

JAK/STAT通路作為廣泛存在于各類細(xì)胞內(nèi)的介導(dǎo)激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通常不能自主發(fā)揮作用,相反,它們受到各種各樣的內(nèi)在和外界刺激的調(diào)節(jié)[20]。這些復(fù)雜的調(diào)控手段為特定細(xì)胞或組織中的轉(zhuǎn)錄輸出提供了調(diào)節(jié)的靈活度[21]。這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完成其生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制是JAK通過結(jié)合細(xì)胞因子及其受體,激活下游底物STAT,進(jìn)而激活靶基因啟動(dòng)子完成調(diào)控作用。越來越多的研究表明,VEGF的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在STAT3的下游[22],當(dāng)VEGF啟動(dòng)子中的STAT3結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí),VEGF的表達(dá)出現(xiàn)了顯著的抑制狀態(tài)[23];研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT可能是通過活性氧簇(ROS)發(fā)生氧化還原反應(yīng)而刺激小鼠的視網(wǎng)膜新生血管生成[24],而AG490,作為JAK2的抑制劑,可以通過抑制JAK2和STAT3的磷酸化,達(dá)到對(duì)下游STAT3途徑的藥理阻滯,從而減少了玻璃體內(nèi)新生血管的形成,本研究也得出了類似的結(jié)果。

既往的研究表明[25],Genistein作為大豆異黃酮的重要成分,已被證明在抗氧化方面有確切作用[26]。而在腫瘤治療方面,除了通過調(diào)節(jié)雌激素受體、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等方式抑制腫瘤的生長(zhǎng)[27],還能通過對(duì)新生血管的抑制作用來預(yù)防腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等[28]。作為酪氨酸激酶的特異性抑制劑,Genistein可以通過抑制酪氨酸酶引起的受體磷酸化和有絲分裂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[29],從而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中,為了直接觀察視網(wǎng)膜血管的情況,我們制備了各組小鼠的視網(wǎng)膜血管熒光造影的鋪片,相對(duì)于正常對(duì)照組,模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的視網(wǎng)膜可見明顯的新生血管簇。與此同時(shí),模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的JAK2和STAT3的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組,據(jù)此可以認(rèn)為高氧誘導(dǎo)下的小鼠視網(wǎng)膜新生血管中的生成會(huì)伴隨著JAK2和STAT3的表達(dá)水平的升高。與之相反,實(shí)驗(yàn)組JAK2和STAT3的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,這表明了Genistein可以抑制JAK2和STAT3的mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)我們觀察到實(shí)驗(yàn)組的鋪片未見明顯的視網(wǎng)膜新生血管簇,可以推測(cè)Genistein可能是通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路,進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成。

當(dāng)視網(wǎng)膜新生血管不可逆轉(zhuǎn)的影響視覺功能時(shí),現(xiàn)有阻斷VEGF的治療措施往往局限于晚期,為了更早介入新生血管的形成,充分研究Genistein在抑制視網(wǎng)膜新生血管形成過程中所發(fā)揮的作用,將會(huì)在視網(wǎng)膜新生血管疾病的治療方面有很好的應(yīng)用前景。但本研究尚存一些不足,比如小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能否成功推廣到其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體實(shí)驗(yàn),再比如通路中是否存在其他反饋機(jī)制,接下來,我們將繼續(xù)深入研究其通路機(jī)制,探索其在劑量、代謝周期等方面展開更多研究。