應(yīng)用于ＰＣＲ性別鑒定的朱鹮糞便基因組提取方法的建立

張漫慧　趙泓淙　王彩霞　王小雨　侯佳　張軍風(fēng)　徐光嵐

摘要：使用無損傷采樣的方法收集朱鹮（Nipponin nippon）的糞便樣品，結(jié)合硫氰酸胍-硅珠法（GuSCN-SiO2）研究出了一種朱鹮糞便基因組提取的試劑配方和操作程序。結(jié)果表明，可應(yīng)用于PCR性別鑒定的朱鹮糞便基因組提取方法的提取效率為85.11%。這種穩(wěn)定有效的朱鹮糞便基因組提取試劑與提取方法可以有效解決目前朱鹮性別鑒定的困難，保證朱鹮人工種群在繁殖季節(jié)合理配對(duì)。

關(guān)鍵詞：朱鹮（Nipponin nippon）;鳥類繁殖;性別鑒定;糞便基因組

中圖分類號(hào)：S814.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1007-273X（2020）08-0005-03

朱鹮（Nipponin nippon）是鸛形目（Ciconiifomes）鹮科（Threskiorothidae）的國家Ⅰ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。朱鹮曾遍布亞州東部和北部地區(qū)，由于人類過度獵殺和棲息地的喪失，朱鹮種群數(shù)量銳減以至被認(rèn)為在野外滅絕[1]。

有效的朱鹮性別鑒定方法在朱鹮繁育過程中可避免錯(cuò)配誤配的發(fā)生。目前朱鹮性別鑒定方法包括以下幾種：根據(jù)外觀和行為來判斷，但準(zhǔn)確率較低[2];腹腔鏡檢的準(zhǔn)確性相對(duì)較高，但操作過程對(duì)鳥類傷害較大，易導(dǎo)致不育甚至死亡;類固醇激素法易受到各種因素的影響，個(gè)體差異性、樣品新鮮度均會(huì)導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，染色體核型分析也是常用的一種性別鑒定方法，但朱鹮大小染色體的辨別與數(shù)量統(tǒng)計(jì)十分復(fù)雜，操作過程繁瑣，不適用于實(shí)踐推廣[3]。

近年來興起的分子生物學(xué)方法具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。鳥類分子生物學(xué)的鑒定位點(diǎn)包括ATP5A1基因、EE0.6序列、染色體螺旋蛋白基因（Chromobox-helicase-DNA binding gene，CHD-1）。鳥類的CHD-1位于性染色體上，高度保守，CHD基因有兩個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W為W連鎖，CHD-Z為Z連鎖，可通過特異性引物對(duì)Z染色體和W染色體上的同源特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4，5]。有研究表明，CHD-1被應(yīng)用于多種單態(tài)性鳥類的性別鑒定[6，7]。付晶等[8]曾通過特異引物2550F/2718R對(duì)CHD-1進(jìn)行特異性擴(kuò)增來鑒定鵪鶉（Coturnix coturnix）性別。針對(duì)朱鹮性別鑒定的引物2550F/2517R對(duì)于CHD-1的擴(kuò)增效果良好，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶[8]。He等[9]使用引物2550F/2517R進(jìn)行朱鹮血液基因組的PCR反應(yīng)并將目的條帶進(jìn)行純化與回收，根據(jù)測序后的序列對(duì)2550F/2517R進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)新引物2467F/2530R，在朱鹮性別鑒定的PCR擴(kuò)增中避免了非特異性條帶的出現(xiàn)。

前期研究一般將血液樣品作為朱鹮性別鑒定的生物學(xué)材料來源，但采樣過程繁瑣，對(duì)朱鹮有直接損害，在實(shí)踐中不宜作為常規(guī)方法進(jìn)行大批量實(shí)施和推廣。鳥類的遺傳學(xué)研究需要采取樣品，而非損傷取樣以及對(duì)采樣動(dòng)物干擾小的優(yōu)勢被普遍應(yīng)用于珍稀鳥類的研究。糞便是無損傷取樣中常用的樣品采集對(duì)象，采樣過程中與動(dòng)物基本無接觸，因此動(dòng)物很少產(chǎn)生應(yīng)激，適合種群數(shù)量小且應(yīng)激較大的鳥類研究取樣[10-12]。目前關(guān)于珍稀鳥類糞便基因組提取的方法在雷鳥（Tetrao urogallus urogallus）、大鴇（Otis tarda）中有所提及，但不同鳥類的食性與消化系統(tǒng)有所差異，對(duì)其方法通用性產(chǎn)生了制約，而市場上的試劑盒較為昂貴且無針對(duì)性。因此，建立一種朱鹮糞便基因組提取并用其進(jìn)行PCR性別鑒定的方法顯得十分迫切。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣品來源

本研究在陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心采集51份朱鹮糞便樣品。使用5 mL糞便采集管采集49份已知性別朱鹮糞便樣品（雌鳥25份，雄鳥24份），分別加入3 mL無水乙醇混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆?使用2 mL注射器翅下靜脈取1份雌性朱鹮血液樣品與1份雄性朱鹮血液樣品。樣品采集詳細(xì)信息見表1。

1.2 ?主要試劑

Quick Taq HS Dye Mix（貨號(hào)：DTM-101，100次反應(yīng)） 購自日本東洋紡公司;SDS購自德國Biofroxx公司;蛋白酶K購自索萊寶公司;異硫氰酸胍購自上海源葉生物公司;聚乙烯吡咯烷酮購自上海藍(lán)季生物公司;無水乙醇與碘化鉀均購自西隴科學(xué)公司;BIOG糞便DNA提取試劑盒（貨號(hào)51031，50次反應(yīng)）購自常州百代生物公司;血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)DP304-02，50次反應(yīng)）與通用型DNA純化回收試劑盒（貨號(hào)DP214-02，50次反應(yīng)）均購自天根生化科技公司。

1.3 ?試驗(yàn)方法

使用試劑盒提取不同性別朱鹮血液基因組DNA，使用朱鹮性別鑒定特異性引物（2467F：5'-CGTCAGTTTCCCTTTCAG-3';2530R：5'-CCAGTGCTTGTTTCCTCA-3'）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸8 min;30個(gè)循環(huán)。

研究使用改良硫氰酸胍-硅珠法提取糞便基因組DNA，確定試劑的組成，優(yōu)化操作程序。使用試劑盒與改良硫氰酸胍-硅珠法提取朱鹮糞便基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化測序，對(duì)本研究建立的改良硫氰酸胍-硅珠法糞便基因組提取質(zhì)量與效率進(jìn)行探究。

1.4 ?改良硫氰酸胍-硅珠法糞便基因組提取法的建立

1.4.1 ?改良硫氰酸胍-硅珠法相關(guān)試劑配制組分

（1）SiO2磁珠懸液。取5 g SiO2固體溶于50 mL去離子水，充分混勻后室溫靜置12 h，棄上清，加入5 mL濃度為8 mol/L的KI溶液，充分混勻后室溫靜置6 h，4 ℃避光保存。

（2）裂解液。終濃度為50 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）、200 mmol/L的NaCl、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）、200 mmol/L的Proteinase K、1% SDS。

（3）提取液。終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH 6.4）、5 mol/L的GuSCN、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）、1.3%的TritonX-100。

（4）洗滌液A。終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH 6.4）、5 mol/L的GuSCN、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）

（5）洗滌液B。終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）溶液、1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）溶液、5 mol/L的NaCl溶液、55%乙醇。

1.4.2 ?改良硫氰酸胍-硅珠法提取步驟的設(shè)計(jì)

（1）取朱鹮糞便懸液500 μL于2 mL離心管中，12 000 r/m離心2 min棄上清液，加入1 mL PBS振蕩重懸沉淀，重復(fù)此步驟至上清無色，加入1 mL PBS浸泡1.5 h。

（2）12 000 r/m離心10 min棄上清液，加入1 mL裂解液，充分振蕩混勻后放入37 ℃恒溫振動(dòng)培養(yǎng)箱過夜（12～16 h）。

（3）12 000 r/m離心10 min，取600 μL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入800 μL提取液，37 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)10 min。

（4）將上述溶液700 μL轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12 000 r/m離心2 min棄上清液，再將剩余的700 μL溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12 000 r/m離心2 min棄上清液。

（5）向柱中加入200 μL SiO2磁珠懸液室溫靜置20 min。

（6）12 000 r/m離心1 min后棄上清液，向吸附柱內(nèi)加入500 μL的洗滌液A，12 000 r/m離心2 min棄上清液。重復(fù)一次。

（7）向吸附柱內(nèi)加入500 μL洗滌液B，12 000 r/m離心2 min棄上清液。重復(fù)一次。將吸附柱室溫開蓋放置5 min，徹底晾干洗滌液。

（8）取出離心柱放入新的1.5 mL離心管，向離心柱吸附膜懸空滴加60 μL去離子水，55 ℃放置5 min，12 000 r/m離心1 min收集DNA溶液。

（9）將上一步收集的DNA溶液重新滴加到吸附膜，55 ℃放置5 min。12 000 r/m離心2 min，收集DNA溶液。置于-20 ℃冰箱。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?朱鹮性別鑒定引物2467F/2530R的驗(yàn)證

將朱鹮血液總基因組DNA作為模板，2467F/2530R為引物按照上述反應(yīng)體系與反應(yīng)程序進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，雄性朱鹮出現(xiàn)一條552 bp的條帶，雌性朱鹮出現(xiàn)353 bp與552 bp的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

2.2 ?改良硫氰酸胍-硅珠法與試劑盒法提取糞便基因組進(jìn)行性別鑒定的效果對(duì)比

將分別使用試劑盒與改良硫氰酸胍-硅珠法進(jìn)行朱鹮糞便基因組總DNA提取的基因組樣本為模板、以雌性血液樣本基因組和雄性血液樣本基因組作為陽性對(duì)照進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，改良硫氰酸胍-硅珠法與試劑盒法所得到的朱鹮糞便基因組均可以作為朱鹮性別鑒定的DNA模板（圖2）。

2.3 ?改良硫氰酸胍-硅珠法進(jìn)行朱鹮性別鑒定的效果分析

采用改良硫氰酸胍-硅珠法從47份糞便樣品中提取朱鹮總基因組DNA。共得到40份濃度與純度處在正常范圍內(nèi)的基因組模板（19份雌性糞便樣品，21份雄性糞便樣品），普通PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，可鑒定其性別。綜上，改良硫氰酸胍-硅珠法提取基因組DNA進(jìn)行朱鹮性別的鑒定效率為85.11%。證明引物2467F/2530R可用于朱鹮性別鑒定，雄性朱鹮出現(xiàn)1條552 bp的條帶，雌性朱鹮出現(xiàn)353與552 bp兩條帶，建立的朱鹮糞便基因組改良硫氰酸胍-硅珠法驗(yàn)證47份朱鹮糞便樣品，85.11%可用于PCR擴(kuò)增的基因組模板。

3 ?討論

人工種群的維持和擴(kuò)大是朱鹮保護(hù)工作中重要的一環(huán)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，鳥類性別鑒定的通用引物也已經(jīng)在朱鹮血液基因組上得到驗(yàn)證并改進(jìn)。無損傷取樣較傳統(tǒng)的取樣方法對(duì)動(dòng)物應(yīng)激小，對(duì)采樣對(duì)象幾乎無影響，尤其是糞便樣品的采集，對(duì)動(dòng)物無接觸，優(yōu)勢更加明顯，被廣泛應(yīng)用于珍稀野生動(dòng)物的研究[13，14]。糞便不止作為一種生物資源被人們有效利用，并且作為最安全的無損傷取樣材料，是朱鹮進(jìn)行性別鑒定良好的基因組來源[15]。

有國外研究者使用硫氰酸胍-硅珠法在大鴇糞便中成功提取出基因組DNA，國內(nèi)研究者用同樣的方法并未成功提取出白頭鶴糞便基因組DNA[16]，繼而對(duì)提取方法加以優(yōu)化，成功進(jìn)行了白頭鶴的性別鑒定。白頭鶴與朱鹮都屬涉禽，本研究在預(yù)試驗(yàn)使用上述方法均未成功提取出朱鹮基因組，表明不同鳥類之間的糞便基因組提取方法差異很大，需要對(duì)硫氰酸胍-硅珠法進(jìn)行改進(jìn)，建立起朱鹮特有的糞便基因組提取方法。

在試驗(yàn)探究的過程中，出現(xiàn)了很多問題，例如DNA濃度非常低甚至無法測出，可能是由于糞便中脫落的腸道上皮細(xì)胞數(shù)量過少，導(dǎo)致提取量過低。在接下來的試驗(yàn)中加大了糞便量，DNA濃度有所上升，但仍然會(huì)有一部分糞便DNA由于濃度過低而無法測出，推測是由于提取液過少引起的提取效率低下所致。將提取液與上清液的比例從2∶3提高至4∶3，結(jié)果有所改善，只有極少數(shù)會(huì)出現(xiàn)沒有濃度的情況，但是A260/A230比值小于1。由于本試驗(yàn)的基因組提取方法為硫氰酸胍-硅珠法，極有可能出現(xiàn)胍鹽污染，將洗滌液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)從55%升高至75%，重復(fù)一次樣品洗滌步驟，基本上都得到了較理想的結(jié)果。

對(duì)于改良硫氰酸胍-硅珠法無法提取基因組的樣品，后續(xù)使用試劑盒再次進(jìn)行該糞便基因組的提取，也未提取出可用于性別鑒定的基因組DNA。這說明樣品的采集與保存可能存在問題，因此針對(duì)樣品的保存方法還值得進(jìn)一步探究。常見的糞便保存方法主要有無水乙醇保存法、70%乙醇保存法、-80 ℃冷凍法、烘干法、冷凍干燥法和硅膠干燥法等。不少研究者對(duì)上述糞便保存方法進(jìn)行了效果比較分析，得出的結(jié)論也不盡相同[17，18]。筆者結(jié)合相關(guān)報(bào)道，推測不同種類的動(dòng)物有食性和消化系統(tǒng)的區(qū)別，糞便保存的方法可能也因物種而異[13-18]。本研究采用了無水乙醇保存法，未對(duì)不同糞便樣品保存方法進(jìn)行分析比較，或許有更優(yōu)于無水乙醇的樣品保存方法等待著進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

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收稿日期：2020-06-10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31771301）;陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（2019JM-038）

作者簡介：張漫慧（1995-），女，安徽阜陽人，在讀博士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖，（電子信箱）862314341@qq.com。