大豆滯綠(stay-green)突變體誘變后代生理指標(biāo)及品質(zhì)分析

鄭 赟 尹藝臻 溫宏偉,2 王 鵬 李貴全*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 小麥研究所，山西 臨汾 041000)

在植物衰老過程中，會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化導(dǎo)致葉綠素降解，發(fā)生黃化現(xiàn)象，進(jìn)而使光合作用能力下降， 光合產(chǎn)物的形成量也隨之降低，生物量增加變得緩慢直至完全停止[1]。在植株生育末期葉片衰老過程中，會(huì)出現(xiàn)葉綠素不降解或降解不明顯的情況，葉片和果實(shí)仍然保持綠色及較強(qiáng)的光合作用，這種現(xiàn)象稱為滯綠(stay-green)[2]。大豆 [Glycinemax(Linn.) Merr.] 種質(zhì)資源豐富，存在功能型和非功能型2種滯綠突變體。功能型滯綠突變體的葉片衰老機(jī)制受損，葉綠素降解和衰老速率減慢，保持綠色，可進(jìn)行較長時(shí)間的光合作用和生物產(chǎn)量的積累，其生物產(chǎn)量及抗逆能力顯著高于野生型，這類突變體對(duì)提高作物產(chǎn)量具有重要的研究意義。陳駿伯[3]研究發(fā)現(xiàn)“持綠型”小麥的葉片具有高光合活性，使合成的同化物持續(xù)大量地運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ?，從而提高產(chǎn)量。白紅丹等[4]研究‘科豐14’大豆滯綠突變系，發(fā)現(xiàn)突變體成熟后期莖葉和籽粒種皮色均呈現(xiàn)綠色，葉綠素降解較慢，因此大豆滯綠突變體具有提高產(chǎn)量的潛力。非功能型滯綠突變體僅僅是葉綠素降解受到抑制，光合作用仍然隨植物衰老而下降，因此是研究葉綠素降解的理想材料。

作為重要的油料、食用和飼料作物，大豆為全世界提供了30%的植物油脂及60%植物蛋白，其營養(yǎng)價(jià)值高，含量豐富[5]。大豆蛋白質(zhì)是重要的植物蛋白，含量高達(dá)種子干重的35%～40%[6]，是谷類作物蛋白含量的3～5倍[7]，主要由球蛋白(59%～81%)和白蛋白(8%～25%)組成[8]。大豆蛋白質(zhì)含有8種人體必需氨基酸，其中除蛋氨酸和半胱氨酸，其他氨基酸含量均達(dá)到了世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)[9]。大豆脂肪含量高達(dá)20%[10]，在人體內(nèi)的營養(yǎng)和消化率極高，是一種重要的優(yōu)質(zhì)食用油[9]，主要成分為游離脂肪酸、芳香油、固醇、色素和有機(jī)酸脂類等，不含膽固醇[7]，不飽和脂肪酸含量達(dá)到了脂肪酸總量的60%左右，其中亞油酸含量占50%以上[11]。因此大豆具有預(yù)防高血壓、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松和心腦血管疾病等功效[12-14]。

目前，由于作物本身特性及育種水平等因素的限制，我國大豆生產(chǎn)面臨著單產(chǎn)、品質(zhì)水平均較低等嚴(yán)峻問題，嚴(yán)重影響市場競爭力，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆的選育受制于生態(tài)環(huán)境復(fù)雜、種質(zhì)資源匱乏和雜交育種方法單一等因素[5]。相關(guān)研究表明大豆產(chǎn)量與品質(zhì)、蛋白質(zhì)含量和脂肪含量間都存在一定程度上的負(fù)相關(guān)[15-16]，對(duì)雙高品種的創(chuàng)制提出了較大的挑戰(zhàn)。大豆滯綠突變體的發(fā)現(xiàn)為大豆育種提供了新的研究思路，其獨(dú)特的葉綠素不降解特性為選育兼顧雙高品質(zhì)及高產(chǎn)大豆品種提供了更多的可能。滯綠大豆的品質(zhì)性狀相關(guān)方面的研究鮮有報(bào)道。本研究以誘變得到的大豆滯綠突變體M6代為試材，按照種皮色和子葉色進(jìn)行分類，對(duì)各類群體的光合速率、葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量和脂肪含量進(jìn)行測定并統(tǒng)計(jì)分析，并發(fā)掘其中潛在的優(yōu)質(zhì)品系，旨在闡明滯綠突變體中葉綠素降解和大豆品質(zhì)的關(guān)系以及不同類型大豆光合作用的差異，以期為選育特色大豆、高品質(zhì)大豆提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大豆滯綠突變體‘Z-94320’(田間自然突變雙青豆，來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種研究室)及其誘變獲得的突變體M6代分離群體，總計(jì)108個(gè)分離單系。滯綠突變體大豆，種皮色和子葉色均為綠色，褐臍，灰茸毛，紫花，尖葉型，亞有限結(jié)莢習(xí)性，一般有效分枝0～2個(gè)，百粒重20.34 g左右，生育期一般在115～120 d，蛋白質(zhì)含量44.9 g/100 g，脂肪含量21.4 g/100 g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2012年，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種試驗(yàn)室中，利用劑量率為100 R/min的60Co-γ射線對(duì)滯綠突變體‘Z-94320’的干種子進(jìn)行輻射誘變處理，獲得誘變新種質(zhì)。

將誘變所得新種質(zhì)種植于大田，進(jìn)行連續(xù)5代目標(biāo)性狀的自交定向分離篩選，于2017年5月13日在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆育種試驗(yàn)田種植M5代誘變突變體種子，采收獲得108個(gè)M6代的誘變突變體分離單系。依次以1，2，…，108進(jìn)行編號(hào)，將各單系繼續(xù)種植于大田，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，行長5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，重復(fù)3次，田間管理采用常規(guī)技術(shù)。

1.3 測定項(xiàng)目和測定方法

1.3.1葉綠素含量(SPAD值)的測定

用SPAD-502葉綠素測定儀測定M6代群體的苗期、盛花期和衰老期的葉綠素含量，3次重復(fù)。測定時(shí)，隨機(jī)選取誘變后代各分離單系3株，選取頂部同一部位葉片測定，每個(gè)葉片隨機(jī)選取3個(gè)測量點(diǎn)，取其平均值。

選用葉綠素變化率來表示誘變后代材料的滯綠性，以此更好地說明大豆滯綠突變體后代中不同種皮色(綠、淺綠、黃)滯綠的程度和子葉色(綠、黃)類型在衰老過程中與葉片葉綠素降解的關(guān)系，本研究中葉綠素變化率=(衰老期葉綠素含量-盛花期葉綠素含量)/盛花期葉綠素含量×100%。

1.3.2光合參數(shù)的測定

大豆進(jìn)入鼓粒期后，選光線好的晴天， 9：00—15：00用CI-340光合儀測定M6代各分離單系的光合參數(shù)，3次重復(fù)，光照強(qiáng)度為1 000 μmol/(m2·s)左右。

1.3.3品質(zhì)性狀的測定

成熟后，將M6代植株上收獲的籽粒曬干，置于Infratec TM 1241 Grain Analyzer V5.00品質(zhì)分析儀中，檢測籽粒中蛋白質(zhì)和脂肪的含量，進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel對(duì)統(tǒng)計(jì)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 24.0和DPS 6.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滯綠突變體后代分離系的葉綠素含量比較

滯綠大豆誘變后代群體中出現(xiàn)了豐富的變異(圖1和圖2)，根據(jù)種皮色和子葉色將其分為4種類型，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中Ⅰ類種皮色綠色和子葉色綠色；Ⅱ類種皮色淺綠色和子葉綠色；Ⅲ類種皮色淺綠色和子葉色黃色；Ⅳ類種皮色黃色和子葉色黃色。

(a)豆莢顏色的變異；(b)莢粒數(shù)的變異；(c)同色豆莢中的不同顏色籽粒 (a) Variation of pod color; (b) Variation of pod number; (c) Different color seeds of the same color pods圖1 滯綠突變體后代豆莢的變異Fig.1 Variation of pods in the progenies of stay-green mutants

(a)種皮色變異；(b)籽粒顏色從綠變黃 (a) Variation of seed coat color; (b) Seed color changes from green to yellow圖2 滯綠突變體后代的籽粒變異Fig.2 Seed variation of progenies of stay-green mutants

由表1可知，衰老期的葉綠素SPAD值，Ⅰ、Ⅱ類群之間并無明顯差異，但是都顯著高于Ⅲ、Ⅳ類群，葉綠素變化率在4個(gè)類群之間表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。Ⅰ類群葉綠素變化率的范圍在-28.57～31.20%，平均變化率為12.27%，其中僅有材料7、58、76和78出現(xiàn)衰老期葉綠素下降的情況；Ⅱ類群葉綠素變化率的范圍在-21.62～44.85%，平均變化率為10.85%，其中則出現(xiàn)了較Ⅰ類更多的葉綠素降低情況；Ⅲ類群體中衰老期葉片葉綠素SPAD值較前兩類略低，且除8、9、32、43、91號(hào)材料其他都表現(xiàn)為下降，平均變化率為-6.39%；Ⅳ類群體中衰老期葉片葉綠素SPAD平均值僅為19.23，該類群的所有材料都表現(xiàn)出正常的下降情況，平均變化率達(dá)到-47.42%。因此，將Ⅰ、Ⅱ類群劃分為滯綠型，Ⅲ、Ⅳ劃分為普通型。

表1 不同類群的衰老期葉片SPAD值及變化率Table 1 SPAD value during senescence and change rate of each group

2.2 滯綠突變體后代分離系的光合作用比較

由圖3可知，類群Ⅱ的凈光合速率較其他類群顯著低于Ⅳ類群，Ⅰ、Ⅲ類群與其他類群的差異并不顯著，說明子葉色或種皮色的變化對(duì)凈光合速率并無影響；Ⅳ類群的蒸騰速率顯著高于Ⅰ、Ⅲ類群，Ⅱ類群則與其他類群無顯著差異，說明子葉色或種皮色的變化可能對(duì)蒸騰速率也并無影響；Ⅳ類群的氣孔導(dǎo)度顯著高于其他3個(gè)類群，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類群間無顯著差異，說明種皮色的變化可能會(huì)對(duì)氣孔導(dǎo)度產(chǎn)生影響；4個(gè)類群的細(xì)胞間CO2濃度并無差異，說明子葉色或種皮色的變化對(duì)胞間CO2濃度沒有影響。綜合光合作用指標(biāo)發(fā)現(xiàn)除種皮滯綠會(huì)造成氣孔導(dǎo)度的降低外，子葉滯綠或種皮滯綠對(duì)光合作用并未產(chǎn)生明顯影響。

小寫字母表示差異顯著(P<0.05). Lower-case letters indicate significant differences (P<0.05).圖3 各類群光合參數(shù)比較分析Fig.3 Comparison analysis of photosynthetic parameters of each group

2.3 滯綠突變體后代分離系的品質(zhì)性狀比較

從表2可知，滯綠型后代Ⅰ和Ⅱ類群之間的品質(zhì)并無顯著差異，滯綠型后代的蛋白質(zhì)含量與普通型后代的差異極顯著，脂肪含量則與Ⅲ類群存在顯著差異，與Ⅳ類群存在極顯著差異。

由圖4可知，在蛋白質(zhì)含量方面，各類群由大到小分別為：Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ，滯綠型類群明顯高于普通型類群，其中Ⅰ類群的84號(hào)株系總蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到46.5 g/100 g，Ⅳ類群的105號(hào)株系含量最低為40.9 g/100 g。在大豆的脂肪含量方面，各類群由大到小分別為：Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ,其中Ⅲ類群的91號(hào)株系脂肪含量最高，達(dá)到22.1 g/100 g，Ⅳ類群的105號(hào)株系含量最低為20.6 g/100 g，滯綠型類群雖然高于普通型，但是Ⅲ類群高于Ⅰ類群的情況也不能忽略，這可能是由于蛋白質(zhì)含量和脂肪含量存在負(fù)相關(guān)性的影響，過高的蛋白質(zhì)積累抑制了脂肪含量的增長。通過與對(duì)照株系(CK)的蛋白質(zhì)含量和脂肪含量相比較，各M6代株系的變化有增有減，但是各類群的蛋白質(zhì)含量平均水平則表現(xiàn)為全部降低，脂肪含量除類群Ⅳ降低其他三類均為增高。綜合來看，滯綠性狀對(duì)改善大豆品質(zhì)有顯著的影響，蛋白質(zhì)和脂肪含量同時(shí)增加是存在可能的。

表2 各類群品質(zhì)的的差異顯著性分析Table 2 Analysis on the difference of quality of each group

(a)蛋白質(zhì)含量的變化；(b)脂肪含量的變化 (a) Changes in protein content; (b) Changes in fat content圖4 各類群的品質(zhì)變化趨勢(shì)Fig.4 Quality change trend of various groups

滯綠突變體生育期葉綠素的變化會(huì)影響到植物自身有機(jī)物的積累，因此葉綠素變化率和蛋白質(zhì)、脂肪含量存在一定關(guān)系。由表3可知，在滯綠突變體后代中，葉綠素變化率、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量均與衰老期葉綠素含量存在著極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，蛋白質(zhì)含量和脂肪含量均與葉綠素變化率存在著極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，說明葉綠素含量的增長會(huì)極顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)含量和脂肪含量的增加。滯綠型大豆則可以使葉綠素含量長期維持在較高水平，從而使蛋白質(zhì)和脂肪含量均顯著提高，由此推斷，滯綠大豆可以作為培育雙高(高蛋白高脂)大豆品種的種質(zhì)材料。

3 討 論

近幾年對(duì)滯綠突變體的鑒定和有關(guān)基因的克隆加快了對(duì)葉片葉綠素降解的研究，高等植物葉片葉綠素降解的脫鎂葉綠酸氧化酶(Pheide a oxygenase，PaO)途徑已經(jīng)闡明[17]。本研究中根據(jù)種皮色和子葉色將大豆滯綠突變體后代材料進(jìn)行分類，主要側(cè)重于從形態(tài)和生理水平上觀察比較大豆滯綠和誘變后非滯綠大豆的差異及變化規(guī)律。通過研究4種類型誘變后代大豆的生育期葉綠素SPAD值的變化情況及葉綠素在衰老期降解幅度大小，發(fā)現(xiàn)種皮色和子葉色與葉片衰老期葉綠素降解程度存在著很大的關(guān)系。在大豆子葉色一致的情況下，種皮色越綠葉片葉綠素含量的變化率越大，滯綠性越強(qiáng)，反之則滯綠性較弱；種皮色一致(均為淺綠色)的情況下，在大豆衰老期，子葉色為綠色的突變系比黃色的突變系葉片葉綠素含量高，葉綠素降解幅度大，滯綠性強(qiáng)。因此按照種皮和子葉都滯綠與僅種皮滯綠可以劃分為2種大豆種子的滯綠基本類型[18]。Spano等[19]研究發(fā)現(xiàn)硬粒小麥功能性滯綠突變家系‘139’、‘142’、‘196’和‘504’相對(duì)于野生型，葉片葉綠素降解速率減緩，本研究中滯綠大豆相對(duì)于黃色大豆葉片葉綠素降解程度與Spano等[19]的研究結(jié)果一致。Christopher等[20]研究證實(shí)，滯綠小麥品種‘Seri M82’在灌漿期綠葉面積持續(xù)時(shí)間較長，葉綠素降解緩慢。植物滯綠突變體葉綠素降解機(jī)理已在分子基因水平上得以研究[2]，本研究的結(jié)果在生理水平上驗(yàn)證滯綠突變體葉綠素降解的變化情況。

表3 蛋白含量、脂肪含量與葉綠素的相關(guān)性Table 3 Correlation between protein content, fat content and chlorophyll

滯綠大豆在逆境脅迫或衰老的情況下，由于自身葉綠素?zé)o法降解，可以延長抗逆或者衰老的時(shí)間，保證正常的光合作用進(jìn)行，以此提高產(chǎn)量或品質(zhì)。黃瑞冬[21]在對(duì)干旱脅迫下滯綠作物的生理狀況研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，滯綠作物的葉片除葉綠素降解慢還保持著較強(qiáng)的光合作用。陳駿伯[3]發(fā)現(xiàn)持綠小麥在灌漿后期葉片中的活性氧清除系統(tǒng)可以持續(xù)高效地清除活性氧(ROS)和H2O2，從而使其在衰老時(shí)期依舊能夠維持較高的光合速率，使同化物大量積累，從而使產(chǎn)量增加。本研究由于試驗(yàn)條件的限制和材料數(shù)量較多，只測定大豆鼓粒期的光合指標(biāo)。作為決定豆科作物產(chǎn)量高低的關(guān)鍵時(shí)期[22]，鼓粒期會(huì)進(jìn)行大豆生育期各階段最多的籽粒干物質(zhì)積累，且干物質(zhì)積累的狀況直接影響后期大豆產(chǎn)量的形成[23]。按照種皮和子葉色劃分的類群歸類整理統(tǒng)計(jì)，對(duì)各類群大豆鼓粒期的光合指標(biāo)情況進(jìn)行測定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論子葉或者種皮顏色如何，光合作用的強(qiáng)度并未由此造成直觀的改變，但綜合品質(zhì)指標(biāo)的情況發(fā)現(xiàn)，滯綠突變體類群的品質(zhì)指標(biāo)均優(yōu)于黃色種皮黃色子葉的類群，這說明滯綠突變體類群的光合作用比普通大豆突變體類群持續(xù)更久，會(huì)產(chǎn)生更多的有機(jī)物積累，以此達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的特性。

60Co-γ誘變育種的重要目的是改善大豆品質(zhì)[24]。H?rtensteiner[25]研究表明，光系統(tǒng)反應(yīng)中心的葉綠素結(jié)合蛋白對(duì)氮源的高效再利用在植株的生長發(fā)育過程中起到重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，無論滯綠與否，大豆葉片中葉綠素的含量與大豆蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與H?rtensteiner[25]研究結(jié)果一致。任鈞等[20]在已有研究基礎(chǔ)上推測大豆發(fā)育與成熟階段需要從衰老的葉片中導(dǎo)入大量的氮素, 因此滯綠性狀雖然可以影響衰老葉片中蛋白降解與轉(zhuǎn)運(yùn)，但是對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改良是不利的，本研究中類群Ⅰ的滯綠性狀與類群Ⅱ相比更加明顯，若按照滯綠性狀可以使植物進(jìn)行更多有機(jī)物積累的推測，類群Ⅰ的蛋白質(zhì)含量應(yīng)該顯著高于類群Ⅱ，但是實(shí)際結(jié)果恰恰相反，印證了任鈞等[20]的推測。王玫等[26]的研究中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)定性與產(chǎn)量、脂肪含量呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；李志剛等[27]在對(duì)大豆籽粒中干物質(zhì)、脂肪和蛋白質(zhì)積累規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，在大豆籽粒形成前期，蛋白質(zhì)積累量與脂肪積累量呈顯著正相關(guān)，但從中期開始，脂肪積累量便隨著蛋白質(zhì)積累量增加開始出現(xiàn)減少的情況。因此籽粒形成過程中蛋白質(zhì)和脂肪含量同時(shí)增高的情況并不常見，而本研究中的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量與葉綠素含量變化率均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，雖然脂肪含量的增長狀況并未表現(xiàn)十分明顯，其中存在的機(jī)理也有待進(jìn)一步試驗(yàn)探討。