耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌的耐藥性和分子特征*

崔超瓊，周義正，李承彬

湖北省荊州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，湖北荊州 434020

臨床上引起感染的細(xì)菌多為革蘭陰性菌，尤其是腸桿菌科細(xì)菌。近年來(lái)，耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌(CRE)導(dǎo)致的感染不斷增多，已對(duì)全球公共衛(wèi)生健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。CRE感染所帶來(lái)的威脅主要表現(xiàn)在其高傳播性、高耐藥性和高病死率。最近2年本院CRE感染病例呈不斷增多的趨勢(shì)。為遏制該趨勢(shì)和精準(zhǔn)防控CRE流行，本研究以本院近2年來(lái)分離的CRE菌株為研究對(duì)象，對(duì)其流行特點(diǎn)、耐藥現(xiàn)狀和分子型別等方面展開研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集荊州市中心醫(yī)院2017年1月至2019年5月臨床標(biāo)本中分離的91株CRE，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離的菌株，分離自痰40株，尿液17株，分泌物12株，血液10株，胸腔積液、腹水5株，膽汁4株，組織培養(yǎng)2株，腦脊液1株。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)質(zhì)控株為大腸埃希菌ATCC BAA-2469、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705(陰性質(zhì)控株)、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706(陽(yáng)性質(zhì)控株)。

1.2儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司)、ABI 7500 PCR儀(美國(guó)ABI公司)、PowerPac 3000 電泳儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)、BioDoc-It2Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB,杭州濱和微生物試劑公司)、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑和Sangon Bitech擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程上海股份有限公司)、Marker DNA2000(大連寶生物工程有限公司)、E-test 條(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.3菌株保存 將臨床標(biāo)本按照《全國(guó)檢驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)程(第4版)》[1]的要求進(jìn)行接種培養(yǎng)，使用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定細(xì)菌和藥敏試驗(yàn)，選取目標(biāo)菌落，用無(wú)菌濾紙刮取血平板上分純的菌落，置于EP管中，-70 ℃低溫冰箱保存。

1.4菌株復(fù)蘇、鑒定和藥敏試驗(yàn) 將保存的CRE菌株轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板，復(fù)蘇成功的細(xì)菌經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定復(fù)核。用 Vitek 2 Compact 配套 AST-GN16藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；用E-test法復(fù)測(cè)亞胺培南和厄他培南的最低抑菌濃度(MIC)。藥敏結(jié)果按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2018[2]標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.5碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn) 根據(jù)CLSI 2018[2]指南進(jìn)行改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)和乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(eCIM)。篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，僅在mCIM陽(yáng)性時(shí)，eCIM陽(yáng)性結(jié)果才有效，反之，eCIM試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果不作解釋。

1.6耐藥基因檢測(cè) 引物序列查閱文獻(xiàn)[3-5]獲得，由上海生工生物工程上海股份有限公司合成引物。CRE菌株DNA提取參照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒操作，擴(kuò)增碳青霉烯酶基因、ESBLs基因、膜孔蛋白基因及毒力基因，PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL 2×San Taq PCR Mix，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10 μmol/L)2 μL，滅菌水20 μL，DNA模板1 μL，基因退火溫度及循環(huán)次數(shù)見(jiàn)表1,預(yù)變性92 ℃10 min，變性92 ℃ 1 min，退火1 min，延伸72 ℃ 1 min，繼續(xù)延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，并進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)序分析。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列信息

續(xù)表1 PCR擴(kuò)增引物序列信息

1.7多位點(diǎn)序列分型(MLST) 耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌MLST 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html中的引物和標(biāo)準(zhǔn)操作條件擴(kuò)增gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB 7個(gè)管家基因；耐碳青霉烯類藥物大腸埃希菌MLST根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli標(biāo)準(zhǔn)操作擴(kuò)增adK、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA7個(gè)管家基因；耐碳青霉烯類藥物陰溝腸桿菌MLST根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)https://pubmlst.org/ecloacae/標(biāo)準(zhǔn)操作擴(kuò)增dnaA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB和rpoB7個(gè)管家基因;擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果上傳至上述網(wǎng)頁(yè)比對(duì)，查詢得到對(duì)應(yīng)等位基因型和ST型。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用WHONET5.6和SPSS23.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRE菌株藥敏結(jié)果 91株CRE菌株中，重癥監(jiān)護(hù)室(ICU) 27株、外科27株、內(nèi)科17株、兒科15株、其余科室5株。菌種分布中，肺炎克雷伯菌42株，植生克雷伯菌3株，解鳥氨酸克雷伯菌1株，大腸埃希菌23株，陰溝腸桿菌15株，弗氏檸檬酸桿菌3株，摩根摩根菌3株，奇異變形桿菌1株。受試菌對(duì)18種抗菌藥物高度耐藥，其中對(duì)替加環(huán)素敏感性最高(94.5%)，其次為阿米卡星(62.6%)、復(fù)方磺胺甲噁唑(36.2%)，對(duì)其余抗菌藥物敏感性均低于30.0%。陰溝腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的敏感性高于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。有73.9%的大腸埃希菌對(duì)阿米卡星敏感，而60.0%的陰溝腸桿菌和52.3%的肺炎克雷伯菌對(duì)阿米卡星敏感。見(jiàn)表2。

表2 CRE菌株抗菌藥物敏感結(jié)果(%)

2.2mCIM和eCIM聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果 68株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中，66株mCIM結(jié)果陽(yáng)性，23株碳青霉烯酶基因陰性菌株，mCIM結(jié)果均為陰性，mCIM篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的靈敏度為97.1%，特異度為100.0%。53株金屬β-內(nèi)酰胺酶基因陽(yáng)性菌中，50株eCIM結(jié)果陽(yáng)性；38株金屬β-內(nèi)酰胺酶基因陰性菌中，eCIM結(jié)果均為陰性，則eCIM篩選產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的靈敏度為94.3%，特異度為100.0%。15株絲氨酸碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌，eCIM結(jié)果均為陰性，76株絲氨酸碳青霉烯酶基因陰性菌中，70株eCIM結(jié)果陽(yáng)性，則eCIM篩選產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶的靈敏度為100.0%，特異度為92.1%。

2.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 91株CRE菌株中，60株(65.9%)CRE攜帶1種碳青霉烯酶基因，其中耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)KPC(28.5%)，耐碳青霉烯類藥物大腸埃希菌主要產(chǎn)NDM(73.9%)，耐碳青霉烯類藥物陰溝腸桿菌主要產(chǎn)NDM(53.3%)。8株(8.8%)CRE菌株合并2種碳青霉烯酶基因，3株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌中，2株攜帶NDM和IMP基因，1株攜帶NDM和OXA-48基因；1株耐碳青霉烯類藥物大腸埃希菌攜帶KPC和NDM基因；2株耐碳青霉烯類藥物陰溝腸桿菌攜帶NDM和VIM基因；1株耐碳青霉烯類藥物解鳥氨酸克雷伯菌和1株耐碳青霉烯類藥物植生克雷伯菌均攜帶KPC和VIM基因。25.3%的CRE菌株碳青霉烯酶基因陰性。97.6%的耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌攜帶ESBLs基因，其余細(xì)菌100.0%攜帶ESBLs基因。42株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌毒力基因檢測(cè)中，僅有1株檢出毒力基因wcaG(2.4%)。見(jiàn)表3。

表3 PCR擴(kuò)增結(jié)果(n,%)

2.4MLST結(jié)果 42株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌MLST有4類，其中ST11型12株，ST37型8株，ST17型8株，ST147型2株，ST48型1株，未分型11株。23株耐碳青霉烯類藥物大腸埃希菌MLST主要是ST167型17株，未分型6株。15株耐碳青霉烯類藥物陰溝腸桿菌MLST有4類，其中ST418型6株，ST93型4株，ST74型2株，ST175型1株，未分型2株。

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物對(duì)厭氧菌、革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌引起的臨床感染均有一定的療效，被廣泛用于重癥感染患者的治療，因高頻率和不合理地使用抗菌藥物，CRE逐漸增多。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)表明，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥率已達(dá)10.1%[6]。本院分離的CRE中主要是肺炎克雷伯菌(42株)，其次是大腸埃希菌(23株)和陰溝腸桿菌(15株)；菌株多來(lái)源于ICU和外科，此類患者免疫力差，抵抗力低，因此ICU和外科是本院CRE防控的重點(diǎn)。CRE呈現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象，藥敏結(jié)果顯示，CRE對(duì)頭孢唑啉和氨芐西林耐藥率均為100.0%，僅對(duì)替加環(huán)素和阿米卡星敏感性較高，這與其他報(bào)道一致[7]。針對(duì)CRE感染的治療具有挑戰(zhàn)性，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果、耐藥分子類型、感染嚴(yán)重程度和患者健康狀況，選取有效的治療方案。2018版CLSI指出mCIM與eCIM聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度>95.0%，特異度>92.0%。本研究中篩選絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的靈敏度和特異度與之一致，mCIM檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株操作簡(jiǎn)便，成本低，靈敏度和特異度高，一般臨床微生物均可實(shí)施操作[8]。與eCIM聯(lián)合檢測(cè)可篩選產(chǎn)碳青霉烯酶類型，對(duì)臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果顯示，本院主要流行的碳青霉烯酶類型為NDM、IMP和KPC。王素梅等[9]的研究結(jié)果中，KPC和VIM為主要碳青霉烯酶類型；河南部分地區(qū)和海南省5家綜合醫(yī)院收集的CRE菌株中，主要的耐藥基因型均為NDM[10-11]。本次研究中，KPC的檢出率低于NDM；91株CRE菌株中，僅有1株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌檢出OXA-48基因，但國(guó)外報(bào)道的產(chǎn)OXA-48類碳青霉烯酶的耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌較多[12]。需要關(guān)注的是，本研究中檢出8株攜帶2種碳青霉烯酶基因的CRE菌株，提示菌株出現(xiàn)多種耐藥基因共存的情況。

本研究中，25.3%的CRE菌株不產(chǎn)碳青霉烯酶，而ESBLs耐藥基因檢出率為100.0%，因此這23株不產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE菌株的耐藥機(jī)制為高產(chǎn)ESBLs且合并膜孔蛋白的缺失。耐碳青霉烯的高毒力黏液型肺炎克雷伯菌，具有高耐藥和高致病性的特點(diǎn)。毒力基因檢測(cè)結(jié)果中，僅有1株肺炎克雷伯菌檢出wcaG基因，其余毒力基因均未檢出，高毒力的肺炎克雷伯菌的耐藥變異可能導(dǎo)致其毒性降低。

耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌主要流行的MLST分別為ST11型、ST167型和ST418型，產(chǎn)KPC酶的ST11型與我國(guó)流行克隆株的報(bào)道一致[13]。而國(guó)外研究報(bào)道的耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌中ST258型較多[14]。在其他報(bào)道中可見(jiàn)產(chǎn)NDM酶陰溝腸桿菌的MLST主要為ST93型[10]。本院耐藥菌株分子型別較多，存在克隆多樣性傳播。CRE耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣性，使得對(duì)多種抗菌藥物表現(xiàn)出高度耐藥，造成臨床感染治療困難，醫(yī)院感染控制部門必須重視和加強(qiáng)CRE菌株的防控。

總之，本院CRE菌株對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制復(fù)雜，多種耐藥基因并存，分子型別較多。臨床醫(yī)師應(yīng)做好CRE監(jiān)測(cè)和篩查工作，采取有效的醫(yī)院控制措施，遏制CRE菌株在不同患者和不同區(qū)域間流行播散。