木藤蓼不同提取部位抑制黃嘌呤氧化酶活性研究

馬 倩 趙品成 盧永昌,4*

1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院,青海 西寧 8100071；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810007；4.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心,青海 西寧 810007

木藤蓼(FallopiaaubertiiL.Henry Holub)為蓼科何首烏屬半灌木，常以藤莖入藥。藏藥名“勒哲”,多生長(zhǎng)于海拔900～2000 m的山坡灌叢,主要分布于我國(guó)西藏、青海、山西、河南、甘肅等地區(qū)。味甘、苦、澀，清熱解表，藏醫(yī)常用其治療熱性隆病、痹病、黃水病引起的關(guān)節(jié)腫痛[1]。

痛風(fēng)是由于體內(nèi)嘌呤代謝或尿酸排泄異常而引發(fā)的疾病，目前無(wú)法徹底治愈。國(guó)內(nèi)高尿酸血病癥患者已高達(dá)2億人，其中痛風(fēng)病患者已超9000萬(wàn)，且患者人數(shù)每年仍持續(xù)增長(zhǎng)[2-3]。在我國(guó)，痛風(fēng)已然成為僅次于糖尿病的第二大代謝類疾病。

研究顯示，黃嘌呤氧化酶(XOD)可以持續(xù)氧化次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?，尿酸過(guò)高是痛風(fēng)發(fā)病的一大誘因，臨床上常通過(guò)抑制XOD的活性來(lái)降低血液中的尿酸水平，從而達(dá)到治療痛風(fēng)的目的。目前臨床常用的XOD抑制劑主要有別嘌呤醇和非布司他[4-5]。但別嘌呤醇有一定的副作用，如肝腎損傷、發(fā)燒等，因此別嘌呤醇在臨床上的應(yīng)用受到了一定的限制；非布司他是一種非嘌呤類XOD抑制劑，相比于別嘌呤醇藥效更強(qiáng)、更長(zhǎng)，毒副作用更小，但實(shí)驗(yàn)表明其會(huì)加大心血管病的發(fā)病率[6]。

中藥應(yīng)用于痛風(fēng)的治療早有先例。相比化學(xué)藥物而言，中藥的毒副作用更小。中藥材具有多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)，文獻(xiàn)曾報(bào)道過(guò)多種中藥可以通過(guò)抑制XOD的活性來(lái)治療痛風(fēng)。結(jié)合藏醫(yī)臨床用藥和文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究藏藥材木藤蓼及其不同部位提取物的降尿酸作用及抗痛風(fēng)作用。用95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚和水分別得到木藤蓼5個(gè)部位提取物的浸膏，通過(guò)研究其對(duì)XOD的抑制活性來(lái)研究不同部位提取物的抗痛風(fēng)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 低溫冷卻循環(huán)機(jī)(DLK-2007，寧波新芝生物科技股份有限公司)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(POLARstarOmega，中國(guó)香港伯齊科技有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KH-300DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；高速手提多功能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA-N1100，上海愛(ài)明儀器有限公司)；電子分析天平(FA1204T，廈門(mén)雄發(fā)儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑 黃嘌呤氧化酶(LOT:X05N6Y5557,上海源葉生物科技有限公司)，黃嘌呤(LOT:N1903190023,上海源葉生物科技有限公司)，別嘌醇(LOT:L18A6Y3，上海源葉生物科技有限公司)，石油醚，乙醇，乙酸乙酯，正丁醇均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材 木藤蓼樣品[7-8]于 2018年10月采自青海省西寧市，由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為木藤蓼正品，原植物圖如圖1所示。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配置 磷酸緩沖溶液：精密稱取14.1 mg乙二胺四乙酸、3.47 g磷酸氫二鉀，0.48 g磷酸二氫鉀。加入200 mL超純水超聲促溶20 min至溶液呈澄清透明，測(cè)定該溶液pH=7.4，將其轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，定容至刻度線備用。

黃嘌呤溶液：精密稱取黃嘌呤3.83 mg，放入25 mL的容量瓶中。加入300 μL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液超聲至完全溶解，使用磷酸緩沖液定容至刻度線，繼續(xù)超聲20 min，得黃嘌呤溶液儲(chǔ)備液。

黃嘌呤氧化酶(XOD)溶液：取1 mL90 U·mL-1黃嘌呤氧化酶溶液備用。臨用前需用磷酸緩沖液稀釋至濃度為0.08 U·mL-1。

別嘌呤醇儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取別嘌呤醇68.055 mg，加入5 mL二甲基亞砜溶液，即可得到的別嘌醇儲(chǔ)備液[9]。

氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉2 g，加入適量超純水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，定容至刻度線備用。

2.2 木藤蓼提取物不同部位樣品的制備 木藤蓼乙醇提取物的制備：稱量25 g木藤蓼藥材粉末，加入95%乙醇400 mL，回流提取3次，每次提取60 min。合并3次醇提液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋干至無(wú)醇味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼石油醚提取物的制備：將上述得到的浸膏用熱水溶解，加入適量石油醚進(jìn)行萃取，多次萃取直至石油醚萃取液變?yōu)闊o(wú)色，合并萃取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，旋干至無(wú)石油醚味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼乙酸乙酯提取物的制備：在上述石油醚萃取后的水溶液中加入適量乙酸乙酯進(jìn)行萃取，多次萃取直至乙酸乙酯萃取液變?yōu)闊o(wú)色，合并乙酸乙酯萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，旋至無(wú)乙酸乙酯味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼正丁醇提取物的制備：在上述乙酸乙酯萃取后的水溶液中加入適量正丁醇進(jìn)行萃取，多次萃取直至正丁醇萃取液變?yōu)闊o(wú)色，合并正丁醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，旋至無(wú)正丁醇味，收集浸膏并稱重。

木藤蓼水提取物的制備：將上述正丁醇萃取后的水溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，收集浸膏并稱重[10]。

2.3 XOD抑制活性篩選體系的優(yōu)化 在96孔板中依次加入100 μL磷酸鹽緩沖液和50 μL 0.08U·mL-1的黃嘌呤氧化酶溶液，37 ℃條件下孵育3 min,再加入50 μL不同濃度的黃嘌呤溶液(濃度依次為500 μmol/L、400 μmol/L、300 μmol/L、200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L)啟動(dòng)反應(yīng)，每個(gè)濃度平行設(shè)置三個(gè)孔，設(shè)置波長(zhǎng)為295 nm，在此波長(zhǎng)處每隔 19 s 讀數(shù)一次，記錄吸光度，直到各濃度達(dá)到平臺(tái)期，篩選出最佳濃度條件。

2.4 木藤蓼提取物XOD抑制活性篩選取 100 μL樣品試液，放入96孔板中，加入50 μL 0.08 U·mL-1黃嘌呤氧化酶，37℃條件下孵育3 min，再加入50 μL濃度為100 μmol/L的黃嘌呤溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，于295 nm處每隔19 s讀數(shù)一次，記錄吸光度值A(chǔ)。每組樣品平行設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔，取平均值。再測(cè)定樣品試液自身的吸光度和無(wú)樣品試液時(shí)酶與底物反應(yīng)后的吸光度，按照下列公式[11]計(jì)算抑制率。

式中：A樣空白：體系中提取物樣品溶液的吸光度值，A陰性：體系中無(wú)樣品溶液時(shí)酶與底物反應(yīng)后的吸光度值，A樣：樣品溶液酶促反應(yīng)后的吸光度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)篩選后的結(jié)果，對(duì)木藤蓼提取物不同部位的體系濃度進(jìn)行考察，使用Graphpad Prism5軟件來(lái)計(jì)算IC50。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃嘌呤氧化酶抑制活性篩選體系優(yōu)化 酶的底物濃度會(huì)對(duì)酶抑制劑的活性造成影響，所以必須對(duì)底物濃度進(jìn)行考察，篩選出最佳濃度條件。如圖2所示，當(dāng)酶濃度保持不變時(shí)，加入不同濃度的黃嘌呤溶液，反應(yīng)值與黃嘌呤溶液的濃度成正比，但是當(dāng)所有酶與底物完全反應(yīng)后，即使底物濃度繼續(xù)增加，其中間產(chǎn)物濃度依然保持不變。酶反應(yīng)速率達(dá)到平臺(tái)期。與酶動(dòng)力學(xué)相符合。當(dāng)?shù)孜锏淖罱K濃度是100 μmol/L時(shí)，OD值的信號(hào)檢測(cè)窗為0.6～1.2，并且在5 min時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，此時(shí)系統(tǒng)誤差最低，并能夠確保有充足的操作時(shí)間，因而選擇在此條件下做下一步的研究。并且得到線性回歸方程：y=0.005x+0.6155(R=0.9995)如圖3所示。

3.2 木藤蓼XOD抑制活性篩選 木藤蓼95%乙醇提取物、正丁醇提取物、石油醚提取物、水提取物以及乙酸乙酯提取物對(duì)XOD的抑制活性見(jiàn)表1。濃度為0.5 mg·mL-1的木藤蓼提取液中，95%乙醇提取液以及正丁醇提取液表現(xiàn)出了較強(qiáng)的XOD抑制活性，乙酸乙酯提取液、水提取液抑制作用次之，石油醚提取液對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性最弱。

表1 木藤蓼不同溶劑提取物黃嘌呤氧化酶抑制活性結(jié)果

3.3 木藤蓼不同部位提取物的活性量效關(guān)系 根據(jù)篩選出來(lái)的結(jié)果，將木藤蓼各個(gè)部位提取物進(jìn)行活性篩選，篩選結(jié)果見(jiàn)表2。不同部位提取物中，正丁醇部位提取物活性最強(qiáng)[12]。

表2 木藤蓼不同部位提取物XOD抑制活性IC50

4 討論

本次的實(shí)驗(yàn)采用體外抑制XOD活性篩選法，對(duì)木藤蓼不同部位提取物進(jìn)行了活性篩選。由于本次實(shí)驗(yàn)是一個(gè)酶促實(shí)驗(yàn)，需要先進(jìn)行XOD抑制活性篩選體系進(jìn)行優(yōu)化，選擇合適的底物濃度。酶與底物濃度是否合適，會(huì)直接影響到篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此實(shí)驗(yàn)中，樣品加入后可與酶及底物發(fā)生酶促反應(yīng)，而每次讀數(shù)均會(huì)有微小差異，因此需要設(shè)置空白，扣除空白以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)黃嘌呤濃度達(dá)到100 μmol/L，反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí)，OD數(shù)值將處于0.6～1.2之間，系統(tǒng)誤差最低。

通過(guò)篩選后發(fā)現(xiàn)，濃度為0.5 mg/mL的木藤蓼95%乙醇部位提取物對(duì)XOD有明顯的抑制作用，正丁醇部位提取物及水和乙酸乙酯部位的提取物抑制作用次之，石油醚提取物抑制作用最低。IC50越低，表明其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率越高，活性越強(qiáng)。通過(guò)對(duì)IC50的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正丁醇部位提取物相對(duì)于其他部位提取物顯示出了更強(qiáng)的XOD抑制作用。

據(jù)國(guó)內(nèi)外藥理活性研究報(bào)道，蘆丁、金絲桃苷具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13-16]的藥理作用，多數(shù)黃酮類具有抑制黃嘌呤氧化酶的作用[17]，文獻(xiàn)顯示木藤蓼中具有此類化合物[18],也有文獻(xiàn)顯示，木藤蓼的醇提物對(duì)于疼痛反應(yīng)有明顯的抑制作用，可以提高小鼠疼痛反應(yīng)的閾值，并且可以將緩解由于二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳廓腫脹[19]，而乙醇和正丁醇部位提取出的物質(zhì)多為黃酮類,木藤蓼對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用可能與此有關(guān)，但需進(jìn)行更深層次的研究，其對(duì)黃嘌呤氧化酶發(fā)揮抑制作用的具體機(jī)制也需進(jìn)一步深入探究。從實(shí)驗(yàn)室資金消耗以及木藤蓼資源消耗方面考慮，95%乙醇部位的提取物和正丁醇部位的提取物對(duì)XOD的抑制作用相差不大，IC50數(shù)值也較接近，若需大量應(yīng)用時(shí)可以同時(shí)利用兩個(gè)部位的提取物，一些情況下也可以選擇優(yōu)先使用水提物，避免資源的浪費(fèi)。

5 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)以紫外分光光度法為基礎(chǔ)，測(cè)定時(shí)間短，數(shù)據(jù)處理方法簡(jiǎn)便，證明了木藤蓼不同部位提取物均對(duì)黃嘌呤氧化酶有抑制作用，可以同時(shí)測(cè)定多種藥材不同部位提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用，不僅為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和合理利用木藤蓼提供依據(jù)，也為其他研究提供新的思路。