桉樹根際放線菌的分離、初步鑒定及酶活篩選

樊炳君，曹艷茹,2*，紀開娟，段 嬌，羅昆艷，姚 麗，朱?，?，侯秀麗

(1.昆明學院 農(nóng)學與生命科學學院，云南 昆明 650214；2.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；3.臨滄市第一中學 天有實驗學校，云南 臨滄 677000；4.楚雄州祿豐縣恐龍山鎮(zhèn)人民政府，云南 祿豐 651212)

桉樹(EucalyptusrobustaSmith.)為桃金娘科桉屬重要種，主要分布區(qū)在澳大利亞和其附近的各島嶼[1]．如今，桉樹是世界三大造林樹種(楊樹、桉樹、松樹)之一，也是中國南方最重要的造林樹種．據(jù)統(tǒng)計，至2005年云南有多達109個縣(市、區(qū))種植桉樹，種植面積高達23.6萬hm2．桉樹不僅被用作經(jīng)濟林樹種，還可作為大面積的防護林、用材林和薪炭林[2]．但是種植桉樹給人們帶來經(jīng)濟價值的同時，也給生態(tài)環(huán)境帶來了一些問題．眾所周知，桉樹常被人們稱為樹木界的抽肥機和抽水機，長期種植桉樹不僅會改變土壤的理化性質(zhì)，同時對土壤中的微生物種類和數(shù)量也會產(chǎn)生一定影響．李佳雨等[3]研究發(fā)現(xiàn)，桉樹林土壤中的pH、有機碳和全氮含量均顯著降低，土壤中叢枝菌根真菌的豐度也隨桉樹種植時間的增加而減少．李立文[4]在研究桉樹對生態(tài)環(huán)境的影響時發(fā)現(xiàn)，桉樹的根系分泌物和凋落物對其他物種的生長有一定的抑制作用，從而影響周圍環(huán)境的生物多樣性，造成桉樹林地表面光禿、生物種類單一．陳法霖等[5]發(fā)現(xiàn)，桉樹凋落物提供土壤微生物群落生境和食物的能力較弱，致使土壤中的微生物群落生物量、多樣性和代謝活性均降低．目前國內(nèi)外關于桉樹人工林生態(tài)系統(tǒng)的報道[6-9]大多是基于植物和土壤養(yǎng)分的角度，而對于桉樹根際土壤中放線菌的研究尚不多見．

土壤是植物賴以生存的物質(zhì)基礎，而土壤中的微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量、種類及活性都會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能，對環(huán)境也起著天然的“過濾”和“凈化”作用[10]．放線菌是土壤微生物中的一個主要類群，它們的存在反映了生態(tài)多樣性，對自然界物質(zhì)循環(huán)起著重要作用，同時還是很好的生防菌資源．黃冰紛等[11]從土壤中篩選出對松材線蟲有較高殺滅活性的放線菌．龍云川等[12]在綜述貴州省的放線菌資源時分析總結出17株活性放線菌，功能主要集中在產(chǎn)生活性物質(zhì)、拮抗植物病原菌及具生物防治潛力等方面．此外，放線菌還可以合成多種有用的代謝產(chǎn)物，例如維生素、淀粉酶、纖維素酶和氨基酸等，與人類的生產(chǎn)生活關系緊密[13]．

雖然近幾年我國有很多學者已對桉樹人工林土壤微生物、土壤動物和病蟲害防治進行研究，但針對云南桉樹人工林根際土壤中的放線菌研究卻很少．因此，本試驗采集云南省牟定縣桉樹人工林的根際土壤，分離其中的放線菌，在分析該地桉樹根際土壤中放線菌的多樣性的基礎上檢測菌株酶活，以期從根際微生物生態(tài)的角度來探討桉樹人工林的生態(tài)效益和生物多樣性問題．并通過分析桉樹根際土壤放線菌的數(shù)量和種類，闡明桉樹人工林地土壤放線菌的生態(tài)分布規(guī)律，為全面評估云南桉樹的生態(tài)效應，以及后期的桉樹引種、擴大栽培面積提供一些理論依據(jù)，同時獲取一批有價值的放線菌資源．

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域概況和材料

試驗材料采自云南省楚雄州牟定縣(101°35′～101°47′N，25°30′～25°40′E)，境內(nèi)最低海拔 1 140 m，最高海拔 2 897 m，屬于亞熱帶季風氣候區(qū)，年平均氣溫為 15.8 ℃，年平均降雨量為 872 mm，日照充足，氣候溫和．

桉樹林根際土壤的采集在上述試驗區(qū)域內(nèi)進行．在坡向相同、海拔相差在110～ 120 m 的范圍內(nèi)設置樣方，樣方大小為 10 m × 10 m ，以“S”型取樣法在每個樣地隨機選取3個點，除去表層土，取深度為 10 cm 左右的土樣混合為1個樣品．海拔間隔 200 m 按上述方法再采集1個樣品，共計8份桉樹根際土樣，將土樣裝入無菌袋中，帶回實驗室置于 4 ℃ 以待分離．

1.2 分離純化

1.2.1 土樣預處理

將8份樣品進行風干(無菌條件下)，過篩(孔徑 2 mm)后，取 2 g 土樣于 100 ℃ 的烘箱中干熱處理 1 h．將上述樣品加入裝有 18 mL 無菌水的錐形瓶，室溫振蕩 30 min，以待涂布分離．

1.2.2 分離培養(yǎng)基

本研究放線菌分離的培養(yǎng)基參照Taechowisan，Khamna，Lece valier和段淑蓉等的方法配制HV培養(yǎng)基[14]、海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基[15]、甘油精氨酸瓊脂[16]、棉籽糖組氨酸培養(yǎng)基[16]、海藻糖-天門冬酰胺培養(yǎng)[17]、土壤浸汁培養(yǎng)基[17]，并結合楊宇容等[18]的方法在前5個分離培養(yǎng)基中加入 75 μg/mL 重鉻酸鉀，在第6個分離培養(yǎng)基中加入 0.06 g/L 制霉菌素，用以抑制細菌和真菌的生長．

1.2.3 放線菌分離培養(yǎng)及保藏

將上述預處理好的樣品進行梯度稀釋，取 200 μL 質(zhì)量濃度為10-3倍的土壤稀釋液置于培養(yǎng)基上并涂布均勻，靜置 0.5 h 后倒置恒溫培養(yǎng)箱中，溫度為 28 ℃．7～ 21 d 后，觀察并統(tǒng)計出菌情況，將放線菌單菌落挑取出來，以平板進行劃線純化，將純化好的菌株接種于牛奶管、斜面、甘油管，置于低溫保藏．

1.3 放線菌的初步鑒定

根據(jù)形態(tài)特征選取代表菌株，按宮強等人[19]的方法對代表菌株的總DNA進行提取，采用Marchesi等[20]設計的引物(PA:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行16S rRNA基因的特異擴增，隨后送到美吉測序公司進行測序．將獲得的16S rRNA基因序列提交到ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/identify)進行比對[21]，調(diào)取相似性較高的菌株序列，利用MEGA 7軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)對其進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，最終確定放線菌種屬．

1.4 放線菌酶活檢測

對選取的進行初步鑒定的21株代表性菌株進行淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和脂肪酶活性檢測．

1.4.1 菌株活化

將21株放線菌轉接到ISP 2培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng) 5 d 后備用．

1.4.2 酶活性檢測

1)培養(yǎng)基的制備．按照張萬芹等[22]的方法配制基礎培養(yǎng)基、淀粉酶活檢測培養(yǎng)基、纖維素酶活檢測培養(yǎng)基、蛋白酶活檢測培養(yǎng)基和脂肪酶活檢測培養(yǎng)基．并根據(jù)不同的水解酶活性檢測方法，將不同的底物加入基礎培養(yǎng)基中， 同時平板下層加入水瓊脂層，以便觀察．

2)接種培養(yǎng)．將21株放線菌分別接種到4種酶活性檢測培養(yǎng)基上，置于 28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，每株菌每種酶接種兩次，即兩個重復．

3)酶活檢測．纖維素酶活檢測[23]：在菌株已長好的平板上倒入配置好的剛果紅溶液，待其染色 1 h 后，將染色液倒出，再用NaCl溶液脫色 20 min 后觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)，記錄菌落邊緣與透明圈邊緣的距離，距離越大則酶活越好．

淀粉酶活檢測：在菌株已長好的平板上倒入適量碘液，若變藍則表明無酶活；若不變藍，記錄菌落邊緣與透明圈邊緣的距離，距離越大則酶活越好．

脂肪酶活和蛋白酶活檢測：如有酶活，菌落邊緣有透明圈形成，記錄其大?。?/p>

2 結果與分析

經(jīng)分離純化后共獲得73株菌，將其分別保存于牛奶管、甘油管和斜面以進行后續(xù)的工作．根據(jù)形態(tài)差異選取了21株代表放線菌進行系統(tǒng)進化分析及酶活檢測．

2.1 放線菌在6種培養(yǎng)基上的出菌情況

放線菌的生長數(shù)量統(tǒng)計如圖1所示．在采用的6個培養(yǎng)基上，放線菌的數(shù)量呈現(xiàn)HV培養(yǎng)基≈海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基<海藻糖-天門冬酰胺培養(yǎng)<棉籽糖-組氨酸培養(yǎng)基<甘油-精氨酸瓊脂<土壤浸汁培養(yǎng)基的趨勢．其中：以采樣地土壤制成的土壤浸汁培養(yǎng)基放線菌出菌率最高，最適合該樣品放線菌的分離；富含有機質(zhì)的HV培養(yǎng)基和海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基分離效果最差．這可能和該地營養(yǎng)被桉樹強勢吸收而使得適應寡營養(yǎng)的放線菌類群大量存在有關．

最終，分離純化后共得到73株菌，根據(jù)形態(tài)特征可知其中52株均為鏈霉菌屬菌株．由此可知，桉樹根際土壤放線菌優(yōu)勢類群是鏈霉菌屬菌株．另選取形態(tài)差異較大的21株代表菌株進行16S rRNA基因測序以及系統(tǒng)進化分析．

2.2 分離放線菌的初步鑒定結果

對篩選出的21株放線菌進行16S rRNA基因測序，測序結果如表1所示．其中16株屬于鏈霉菌屬；2株屬小單孢菌屬，其中一株是Micromonosporachaiyaphumensis，另一株是M.schwarzwaldensis；1株屬微球菌屬的Micrococcusaloeverae；1株屬考克氏菌屬的Kocuriagwangalliensis；1株為野野村菌屬的Nonomuraeajabiensis．

表1 21株菌株的測序結果

測序的21株放線菌共分布于5個屬，每個種選取1個有效代表菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建．如圖2所示，基于16S rRNA基因序列構建了Neighbour-joining進化樹．該系統(tǒng)進化樹顯示測序的21株放線菌中有16株聚在一個大支上，為鏈霉菌屬菌株．其中，A24和A66-2為同一株菌；而A9，A52-2，A3，A5，A23-1，A69，A23-2都為Streptomycesdecoyicus，且為此次分離菌株的優(yōu)勢菌株，該菌株可產(chǎn)德夸菌素(decoyinin)和阿洛酮糖素(psicofuranine)，分別可以抑制部分革蘭氏陰性、陽性細菌，這也是此次分離到該菌株較多的原因．另外，其可以抑制分枝桿菌和某些腫瘤細胞[24]．因此，該菌株還可以作為次級代謝產(chǎn)物研究的菌株材料．

根據(jù)此次桉樹根際土壤分離的73株放線菌的形態(tài)和測序結果可知，68株都為鏈霉菌屬菌株，占到了分離菌株的93%，且在每份樣品中、每種分離培養(yǎng)基上數(shù)量都較多，可見鏈霉菌類群為桉樹根際土的絕對優(yōu)勢放線菌，而僅有7%的分離菌株為其他稀有類群．由此可知，桉樹根際土的放線菌類群組成比較單一．

2.3 潛在新放線菌菌株的分析

分類學工作者Kim等人[25]于2014年提出16S rRNA 基因序列相似度小于98.65%，可以認定為可能的新種或新屬．由測序結果表1可知，本次分離到的菌株A45與正式發(fā)表的菌株Streptomycesfuscichromogenes的16S rRNA 基因序列相似度為97.44%，可能為潛在的新菌株；而菌株267與正式發(fā)表的菌株Nonomuraeajabiensis的16S rRNA基因序列相似度為88.19%，可能為潛在的新屬或更高級別的分類單元．但相關工作需通過后期的多相分類學方法來驗證．

2.4 酶活篩選結果

通過點接法將21株代表菌株接種至淀粉、羧甲基纖維素鈉、脫脂牛奶和三丁酸甘油酯為底物的培養(yǎng)基上篩選其酶活．圖3為試驗中篩選到的部分陽性結果，根據(jù)菌落周圍形成的透明圈來判斷酶活是否產(chǎn)生．

21株菌在上述4種底物培養(yǎng)基上生長7 d之后，酶活篩選結果如表2所示．有4株菌(占篩選菌株總數(shù)的19.0%)脂肪酶活性呈陽性；有7株菌(占篩選菌株總數(shù)的33.3%)淀粉酶活性呈陽性；有6株菌(占篩選菌株總數(shù)的28.6%)纖維素酶活性呈陽性；有5株菌(占篩選菌株總數(shù)的23.8%)蛋白酶活性呈陽性；有7株菌(占篩選菌株總數(shù)的33.3%)的4種酶活都為陰性，即66.7%的菌株都有至少一種酶活．其中，菌株A18 (Streptomycesgeldanamycininus)和菌株267(Nonomuraeajabiensis)具有3種酶活； 而A9(Streptomycessioyaensis)，A24(Streptomycesmauvecolor)，A31(Streptomycesscopuliridis)，A63(Kocuriagwangalliensis)這4株菌都具有兩種酶活，這些活性菌株對于淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶的開發(fā)應用提供了更多研究材料． 在供試的16株鏈霉菌中，有高達75%的菌株(12株菌)至少有1種酶活，由此說明桉樹根際土壤蘊藏著酶活較多的鏈霉菌資源．

表2 21株代表菌株酶活篩選結果

續(xù)表2

3 討論

本試驗對云南省楚雄州牟定縣桉樹根際土壤放線菌進行了分離，同時分析了該樣品放線菌的數(shù)量及類群組成，在此基礎上篩選了分離菌株的4種酶活性．通過稀釋平板法從8份桉樹根際土壤樣品中共分離獲得73株放線菌．分離結果顯示，8份樣品在不同培養(yǎng)基上放線菌的生長情況和數(shù)量差異很大．其中，以采樣地土壤制成的土壤浸汁培養(yǎng)基放線菌出菌率最高，因此土壤浸汁培養(yǎng)基較適合桉樹根際土壤樣品放線菌的分離，推測可能是由于桉樹大量吸收養(yǎng)分而形成的貧營養(yǎng)環(huán)境的選擇作用使得適應寡營養(yǎng)的放線菌類群占據(jù)了絕對優(yōu)勢的原因．由此提示，今后在選擇放線菌分離培養(yǎng)基時要充分調(diào)查考慮采樣地的背景組成特點來設計分離培養(yǎng)基，才能得到較為理想的分離效果．

在分離得到的73株菌中，根據(jù)形態(tài)特征可知其中52株均為鏈霉菌屬菌株．另選取形態(tài)差異較大的進行16S rRNA基因測序以及系統(tǒng)進化分析的21株代表菌株中有16株也為鏈霉菌屬菌株，一共68株菌(占分離菌株總數(shù)的93.15%)為鏈霉菌的不同種及亞種，說明牟定縣桉樹林根際土中的放線菌優(yōu)勢類群是鏈霉菌．根據(jù)目前的研究表明，放線菌中數(shù)量最大、應用最廣的一類是鏈霉菌．Yu等[26]從來源于廈門紅樹林的1株鏈霉菌中獲得具有抗真菌及抗腫瘤作用的物質(zhì)．謝玉琴等[27]發(fā)現(xiàn)婁徹氏鏈霉菌對小麥幼苗有很好的促生作用．在本試驗中獲得的鏈霉菌屬菌株為后期放線菌的綜合利用及生理活性物質(zhì)的定向篩選提供了較好的物質(zhì)資源．與此同時，本試驗發(fā)現(xiàn)，楚雄州牟定縣桉樹林根系土壤中的微生物種類單一，物種豐富度不高．生物多樣性會直接影響一個地區(qū)甚至一個生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性．若生物種類單一，則會導致生態(tài)系統(tǒng)十分脆弱．此外，桉樹種植會干擾林下動植物的多樣性[28]．而且，本研究也表明，桉樹的根際土壤放線菌類群較單一，這對于當?shù)氐纳鷳B(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性很不利．

本研究在分離桉樹根際土壤放線菌的基礎上利用平板點接法對分離放線菌進行了酶活檢測．在篩選的21株放線菌中，有4株菌產(chǎn)脂肪酶，7株菌產(chǎn)淀粉酶，6株菌產(chǎn)纖維素酶，5株菌產(chǎn)蛋白酶，66.7%的篩選菌株至少有一種酶活．可見，桉樹根際土壤放線菌的酶活性比較好，后期可進一步詳細研究酶活陽性菌株的產(chǎn)酶條件等相關酶學性質(zhì)，也可利用核糖體工程等更為先進的方法對其進行處理改造提高酶的活力和產(chǎn)量，一方面可以提高桉樹根際土壤微生物資源的利用率，另一方面為酶工業(yè)生產(chǎn)提供更多生物資源．