小麥TaTCTP 蛋白的原核表達及抗體制備

麻 楠, 孫天杰, 劉 超, 焦園園, 王冬梅

(華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/ 河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/ 河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院， 河北 保定 071001)

小麥(Triticum aestivum L.)是世界上重要的糧食作物，而其產(chǎn)量受到多種病害的影響。由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起小麥葉銹病，是造成小麥產(chǎn)量減少的主要病害之一［1-2］。減少真菌病害是提高小麥產(chǎn)量的有效途徑，盡管化學藥劑可用于防治小麥真菌病原體，但培育抗病品種是一種更具成本效益和有利于環(huán)境保護的主要措施［3］。

翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein, TCTP)是廣泛存在于真核細胞中的一種蛋白，并且高度保守［4-5］。在動物中，TCTP 可以調(diào)控生長發(fā)育［6］、保護染色體［7］、參與細胞凋亡［8］、調(diào)節(jié)組胺的釋放［9,10］和調(diào)控微管穩(wěn)定性［11］等生物學功能。到目前為止，對于TCTP 在植物中的功能的相關研究相對較少。在擬南芥中TCTP 參與細胞生長及分裂，且當TCTP 沉默后，其花粉管的形成及生長發(fā)育受阻［12］。在煙草中，TCTP 通過與組氨酸激酶(Tobacco histidine kinase, NTHK)相互作用來響應乙烯信號［13］。而水稻TCTP 可以響應重金屬汞的脅迫，并減少活性氧對植物造成的傷害［14］。此外，在植物與病原菌互作方面，對TCTP 的功能研究也少有報導。鄭舒暢等研究表明TCTP 參與了小麥抵御白粉菌的侵染過程［15］。番茄和煙草植株中的TCTP 響應胡椒黃花葉病毒(Pepper yellow mosaic virus, PepYMV)的侵染［16］。煙草中的NbTCTP 沉默后，由青枯病菌、菊苣假單胞桿菌和丁香假單胞桿菌誘發(fā)的超敏性反應-細胞程序性死亡(Hypersensitive response- programmed cell death, HR-PCD)面積增加［17］，表明TCTP 的功能與植物受病原菌侵染時HR-PCD 的誘發(fā)有關。

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，HR-PCD 是小麥抵抗葉銹菌侵染的重要防衛(wèi)反應［18-20］。而HR-PCD 受多種信號分子調(diào)控，這其中就包括Ca2+信號［19］、H2O2［21］信號及NO［20］信號。而Ca2+作為上游信號在由葉銹菌侵染小麥誘導的防衛(wèi)反應中發(fā)揮著極為重要的作用［20］。課題組前期工作證明，在葉銹菌侵染小麥過程中，TaTCTP 在轉(zhuǎn)錄水平響應葉銹菌的侵 染［22］，并且位于Ca2+信號通路中。為了對TaTCTP在小麥-葉銹菌互作過程中的作用機制進行深入研究，制備高效、特異的TaTCTP 抗體，對TaTCTP的蛋白水平檢測、互作蛋白篩選等研究是至關重要的。本研究對TaTCTP 基因進行了克隆，制備了TaTCTP 的多克隆抗體，并使用制備的TaTCTP 抗體對TaTCTP 在小麥-葉銹菌互作中的表達水平進行了檢測。研究結果將為深入研究TaTCTP 的生物學功能，以及進一步完善TaTCTP 在小麥-葉銹菌互作中的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料及供試菌株 小麥近等基因系TcLr26、葉銹菌生理小種260 為本課題組保存的植物材料。大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞為本實驗室保存；克隆載體pEASY-T1 購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；原核表達載體pCOLD II 和大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 試劑與藥品 限制性內(nèi)切酶Sac I 和Sal I、T4 DNA 連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、高 保 真DNA 聚 合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、親和層析空柱、Ni 離子親和瓊脂糖凝膠、考馬斯亮藍R-250、1×TBST、脫脂奶粉購自生工生物工程(上海)有限公司；Immobilon Western HRP 底物購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；6×Protein loading buffer、蛋白酶抑制劑、Anti-His 抗體、HRP 標記的羊抗兔IgG 購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物培養(yǎng) 選取健康、飽滿的小麥種子播種于直徑15 cm 花盆中，在晝夜溫度為25/20 ℃，光照時間為14 h/d，日光型鏑燈照射，光照強度為 400 W/m2的人工培養(yǎng)室中培育小麥。

1.2.2 基因克隆及載體構建 選取生長7 d 小麥葉片接種葉銹菌生理小種260 的夏孢子，在接種后 24 h 將接種葉片經(jīng)液氮研磨，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，使用引物TCTP-F： 5’-gagctcatgctcgtgtaccaggacaag-3’ 和TCTP-R： 5’-gtcgacttagcacttgacctctttcagccc-3’(帶有下劃線 序列為酶切位點)擴增TaTCTP 編碼區(qū)全長(長度為507 bp)，連接至克隆載體pEASY-T1 上，經(jīng)藍白斑篩選、PCR 鑒定后，送深圳華大基因科技有限公司北京測序部測序。將測序正確的菌株提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Sac I 和Sal I 酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收TaTCTP 條帶(約為507 bp)，并與同樣經(jīng)過雙酶切的載體pCOLD II 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)。使用引物pCOLD-F： 5’-acgccatatcgccgaaagg-3’和pCOLD-R： 5’-ggcaggg- atcttagattctg-3’對菌落進行PCR 鑒定，鑒定正確的菌落送深圳華大基因科技有限公司北京測序部測序。

1.2.3 蛋白質(zhì)可溶性分析 使用DNAMAN 軟件將克隆得到的TaTCTP 基因序列翻譯為氨基酸序列。使用SignalP 軟件分析TaTCTP 氨基酸序列中的信號肽［23］，參與分析的神經(jīng)網(wǎng)絡偏好設置為真核生物(euk networks)。使用TMHMM 軟件分析TaTCTP 中的跨膜結構［24］。

1.2.4 TaTCTP 蛋白的誘導表達 將測序正確的單菌落，接種至含有100 μg/mL 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)的LB 液體培養(yǎng)基(含有10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、10 g/L NaCl，pH 7.0)培養(yǎng)12 h。次日按1%的接種量在含有100 μg/mL Amp 的LB 液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。當菌液的OD600達到0.5 左右時，將其在冰上冷卻靜置30 min，取菌液加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，于16 ℃，170 r/min 的恒溫搖床誘導表達24 h。

1.2.5 TaTCTP 蛋白的純化 經(jīng)IPTG 誘導處理后的大腸桿菌菌體以25 mL 裂解液(150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris、1% Triton X-100，pH 7.4)

重懸，于4 ℃，320 W 功率，超聲破碎10 min 至菌體呈透明狀。破碎的菌體于4 ℃ 15 000 r/min 離心10 min 后用于純化。在空柱中加入1 mL Ni 離子親和瓊脂糖凝膠，加入5 mL 純化緩沖液(150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris，pH 7.4)以活化凝膠。在純化緩沖液流出后，加入離心后的大腸桿菌裂解上清液與純化介質(zhì)孵育5 min，分別使用含有50、100、250 和500 mmol/L 咪唑的純化緩沖液洗脫并收集。將樣品在10%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE 凝膠上進行電泳。使用考馬斯亮藍R-250 染色，然后用脫色液脫色，不斷更換脫色液至蛋白質(zhì)條帶清晰可見。

1.2.6 TaTCTP 蛋白多克隆抗體的制備及特異性檢測 將2.0 kg 左右的新西蘭大白兔，免疫之前耳靜脈取陰性血清。取400 μg 重組TaTCTP (純化的帶有6×His 標簽的目的蛋白)，用生理鹽水稀釋到500 μL，再加入等體積弗氏佐劑(25% 羊毛脂、75% 石蠟油，2 mg/mL 滅活卡介苗)；用混勻儀將溶液和佐劑混勻，形成油包水。將混勻好的重組TaTCTP 進行背部皮下注射免疫。初次免疫2 周后進行加強免疫，將200 μg 重組TaTCTP 與不含卡介苗的弗氏不完全佐劑等體積混合形成乳劑在背部皮下多點注射。此后每隔10 d，進行第2 次和第3次加強免疫。最后1 次免疫10 d 后，從耳靜脈取血采用ELISA 測定免疫效價。再從頸動脈取血，收集，5 000 r/min 離心10 min。使用ELISA 測定抗體效價，最后使用Protein A 純化IgG。

1.2.7 Western blotting 免疫印跡法檢測抗體特異性 在7 日齡小麥葉片上接種葉銹菌生理小種260，并于接種后0 h 和48 h 取接種葉片，作為葉銹菌侵染前和侵染后樣品。小麥樣品經(jīng)液氮研磨后提取可溶性蛋白，然后經(jīng)10% SDS-PAGE 后，將凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。TBST 緩沖液(10 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.5)洗滌3遍后(每次5 min)，使用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液)室溫封閉1 h。在封閉緩沖液中加入純化后的Anti-TaTCTP 抗體(稀釋1∶1 000)，室溫孵育4 h。使用TBST 緩沖液洗滌3 遍后(每次5 min)，按1∶5 000 稀釋加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，室溫孵育1 h，使用TBST 緩沖液洗滌3 遍，加入HRP 底物，在暗室中顯色并觀察結果。

2 結果與分析

2.1 TaTCTP 的克隆、分析與表達載體的構建

以小麥TcLr26 的cDNA 為模板，成功克隆得到了TaTCTP 編碼區(qū)全長。該基因CDS 區(qū)全長為507 bp ( 圖1A, B)，編碼168 個氨基酸，預期分子量為18.8 kD (圖1C)。分泌蛋白與胞漿蛋白往往需要不同的表達系統(tǒng)。為了確定TaTCTP 是否為分泌蛋白，需要預測該蛋白是否存在分泌信號。SignalP 分析結果顯示，在預測的TaTCTP 氨基酸序列中不含有信號肽信息，表明TaTCTP 為胞內(nèi)蛋白(圖1D)，可以 在不截短的情況下，在大腸桿菌細胞內(nèi)正常表達。TMHMM 分析結果顯示，TaTCTP 蛋白不含有明顯 的跨膜區(qū)(圖1E)，表示該蛋白具有較高的可溶性，其表達產(chǎn)物在大腸桿菌中很可能分布在可溶性組 分中。

對轉(zhuǎn)化有連接TaTCTP 的pCOLD II 載體的大腸桿菌單克隆進行PCR 鑒定，結果顯示，在預期分子量附近可見預期條帶(圖1F)。測序分析結果顯示序列正確，表示原核表達載體pCOLD II-TaTCTP 構建成功。

圖1 TaTCTP 的克隆、分析及表達載體構建Fig.1 Cloning, solubility analysis and expression vector construction of TaTCTP

2.2 TaTCTP 的誘導表達及純化

使用IPTG 誘導大腸桿菌中TaTCTP-6×His 重組蛋白表達，并以Anti-His 標簽抗體為一抗，借助Western blotting 檢測可溶性組分中重組蛋白的表達情況。結果顯示(圖2A)，經(jīng)IPTG 誘導后可以在預期分子量位置檢測到強烈的His 標簽信號，而誘導前則信號很弱，表明TaTCTP-6×His 重組蛋白誘導成功。誘導后大腸桿菌的可溶性組分經(jīng)Ni 離子親和純化，并在50、100、250 和500 mmol/L 的咪唑濃度梯度下洗脫獲得純化后的重組蛋白(圖2B)，其中250 mmol/L 咪唑具有最高的洗脫效率。將純化后的蛋白收集，并電泳檢測純度和濃度(圖2C)。以BSA 為參照，TaTCTP 的濃度可達5 mg/mL 以上，且具有較高的純度，可用于動物免疫。

圖2 重組TaTCTP 的原核表達Fig.2 Prokaryotic expression of recombined TaTCTP

2.3 TaTCTP 抗體的制備及效價檢測

以純化后的TaTCTP 為抗原包被酶標板，使用ELISA 對免疫45 d 后新西蘭大白兔的靜脈血清進行效價檢測。結果顯示(圖3A)，當抗體稀釋梯度從200 ～102 400 倍時，底物反應后測得的OD450/630逐漸減小，最大值一半時對應的抗體稀釋倍數(shù)為 6 400，即為抗血清的效價。進一步用ELISA 檢測使用Protein A 純化后的抗體純化后抗體的效價，結果為6 400，表示純化后的抗體對免疫原具有高親和性。SDS-PAGE 檢測純化后抗體純度(圖3B)，只觀察到抗體重鏈(Heavy chain)和輕鏈(Light chain)的條帶，表示抗體純度較好。

圖3 TaTCTP 抗血清及純化抗體的效價檢測Fig.3 Titer detection of TaTCTP antiserum and purified antibody

2.4 TaTCTP 抗體的特異性檢測

為了檢測TaTCTP 抗體的特異性，將小麥TcLr26 的總蛋白進行電泳，并以BSA 為對照，將純化后的TaTCTP 抗體為一抗，借助Western blotting檢測抗體特異性。結果顯示，在雜交后的整個泳道內(nèi)，只有TaTCTP 預期分子量(18.8 kD)大小處可見清晰條帶信號，且無雜帶，而BSA (預期分子量為66 kD)無法被抗體識別(圖4)。結果表明，TaTCTP抗體特異性良好，該抗體可用于后續(xù)的蛋白表達水平檢測。

圖4 TaTCTP 抗體特異性的Western blotting 檢測Fig.4 Western blotting detection of TaTCTP antibody specificity

2.5 小麥-葉銹菌互作中TaTCTP 的表達

將葉銹菌生理260 接種小麥TcLr26，并于接種后0、48 h 分別檢測接種葉片中TaTCTP 的表達水平，以麗春紅S 染色的Rubisco 大亞基指示上樣標準。結果顯示，在未接種葉銹菌時小麥中TaTCTP 表達水平較低，葉銹菌接種48 h 后TaTCTP 的表達顯著升高(圖5)。這一結果說明，TaTCTP 在蛋白水平響應小麥被葉銹菌侵染。

圖5 TaTCTP 在葉銹菌侵染過程中的表達變化Fig.5 Expression patterns of TaTCTP in response to P. triticina infection

3 結論與討論

植物遭受病原物侵染時，會觸發(fā)多個層面的防衛(wèi)反應。病原物如何被寄主識別，胞內(nèi)防衛(wèi)相關信號又如何傳遞，是諸多植物病理學家關注的重點。Ca2+［19］、H和NO［21］，作為3 種重要的胞內(nèi)第二信使，在小麥與葉銹菌互作的HR-PCD 誘發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。前期研究表明，Ca2+在NO和H2O2信號上游發(fā)揮作用來誘發(fā)HR-PCD，以抵御葉銹菌的侵染［20］。通過2 代測序?qū)π←?葉銹菌互作中的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)進行分析，并使用EGTA 螯合鈣離子，以探究受鈣信號調(diào)控的基因［25］。TaTCTP 在轉(zhuǎn)錄水平受葉銹菌侵染誘導升高，在螯合鈣離子之后其表達水平顯著降低，表示該基因的作用處于鈣信號下游受到鈣離子調(diào)控。為了進一步研究TaTCTP在小麥-葉銹菌互作中的功能及其作用機制，制備高效、特異的抗體具有重要的意義。

用于制備蛋白抗體的免疫原分為兩類：蛋白全長，或其抗原表位。TCTP 是廣泛存在于真核細胞中的一個小的可溶性蛋白，且高度保守，使用蛋白全長作為免疫原是最好的選擇。本研究使用冷激活表達系統(tǒng)，重組蛋白的表達受冷激活啟動子cspA驅(qū)動，可以有效降低背景蛋白水平［26］。常見的蛋白質(zhì)純化標簽有6×His 標簽和GST 標簽［27］，其中6×His 標簽的優(yōu)勢主要為分子量較小，且不影響蛋白的免疫原性；GST 標簽多用來增加蛋白的可溶性，但由于標簽較大，常常在免疫前切除。通過對信號肽及跨膜區(qū)信息進行分析，發(fā)現(xiàn)TaTCTP 不存在信號肽及跨膜域，該蛋白主要分布在細胞質(zhì)內(nèi)，且可溶性較高，為此，本研究使用6×His 標簽進行后續(xù)的蛋白純化。雖然抗血清可直接用于Western blotting 等試驗，但血清中雜質(zhì)較多，所以后續(xù)試驗常面臨背景高、特異性差等問題，因此需要對血清中的抗體進行純化。抗體純化主要有2 種方法：Protein A/G 純化和抗原親和純化［28］?？乖H和純化是指使用免疫原制備親和純化介質(zhì)，可以特異性地純化單一種類的抗體，因而純化產(chǎn)物具有較高的特異性，但得率往往不高，且成本較高。Protein A/G 是抗體的天然配體，對絕大多數(shù)動物的抗體具有較高的親和力，因此純化效率高。本研究使用Protein A 純化抗血清，并得到了特異性較強的純化抗體。使用純化后的抗體對葉銹菌侵染0 h (侵染前)和48 h (侵染后)小麥葉片中TaTCTP 的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)與侵染前相比，侵染后TaTCTP 的蛋白水平出現(xiàn)了顯著上調(diào)，意味著TaTCTP 可能在小麥-葉銹菌互作中發(fā)揮功能。

有研究表明，TCTP 參與植物抵御生物脅迫過程中HR-PCD 的調(diào)控。TCTP 響應小麥對白粉菌的防衛(wèi)反應［15］，對煙草受青枯病菌、菊苣假單胞桿菌和丁香假單胞桿菌誘發(fā)的HR-PCD 有一定調(diào)控作用［17］。TaTCTP 在小麥中響應葉銹菌侵染的具體時間和互作因子亟待進一步研究。隨著本試驗TaTCTP 抗體制備的完成，為深入探討這些問題奠定了基礎。

本研究從小麥TcLr26 中克隆了翻譯控制腫瘤蛋白TaTCTP 基因，并成功構建了TaTCTP 原核表達載體。通過IPTG 誘導冷激活表達，Ni 離子親和純化，獲得了重組TaTCTP 蛋白，將之作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了兔源多克隆抗體。進一步借助Western blotting 試驗證明TaTCTP 的表達響應葉銹菌的侵染。本研究為進一步研究TaTCTP 在小麥與葉銹菌互作過程中的功能及其作用機制奠定了 基礎。