紅外光譜法研究胃蛋白酶在表面上的構(gòu)象變化

郭小咪 張曉軒 褚伍波 江南 李赫

摘?要?胃蛋白酶是哺乳動物的一種極其重要的消化酶，通過水解特定氨基酸間的肽鍵從而分解食物中的蛋白質(zhì)。胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶，對周圍環(huán)境的酸堿度比較敏感。本研究采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術(shù)研究了不同pH值和表面性質(zhì)對胃蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，隨著pH值的增大，β-折疊結(jié)構(gòu)的比例先增加，在pH 3～7之間達(dá)到最大值，然后在溶液為堿性時降低，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例則與之相反。衰減全反射（ATR）晶體表面存在TiO2時，β-折疊結(jié)構(gòu)含量遠(yuǎn)高于其它二級結(jié)構(gòu)，且隨著pH值變化，各二級結(jié)構(gòu)比例沒有明顯的變化。通過對比吸收峰強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶與TiO2表面的相互作用有利于溶液中胃蛋白酶的吸附，表明基底表面的官能團(tuán)對胃蛋白酶的構(gòu)象也有影響。

關(guān)鍵詞?胃蛋白酶; 二級結(jié)構(gòu); pH值; 紅外光譜; 二氧化鈦

1?引 言

蛋白質(zhì)是生物體的重要組成物質(zhì)，在酶的催化、提供機(jī)械支持、物質(zhì)的運(yùn)輸與儲存等幾乎所有的生命活動中具有重要的作用[1]。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能是建立其結(jié)構(gòu)之上的，所以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究很早就引起了研究者關(guān)注。目前，對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相關(guān)知識廣泛建立在四級結(jié)構(gòu)概念的基礎(chǔ)上，其中二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，它主要是由肽鏈上不同酰胺鍵間的羰基氧原子與氨基氫原子之間的氫鍵維系，從而使肽鏈骨架呈現(xiàn)出重復(fù)的規(guī)則構(gòu)象[2]。

研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法中，圓二色譜（CD）[3]采用圓偏振光獲得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，核磁共振（NMR）[4]被用于解析蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，冷凍電鏡（Cryo-EM）[5]可以觀察蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)。這些研究方法十分有效，但是在研究中或者破壞蛋白質(zhì)的活性，或者樣品制備方式比較復(fù)雜。

紅外光譜（FTIR）是研究多肽和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的一種常用技術(shù)[6～9]。相比上述方法，F(xiàn)TIR的樣品制備簡單，并且不會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，在測試時完全保留其活性，可以更加快速、方便、準(zhǔn)確地得到蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息[10，11]，因此應(yīng)用廣泛。然而，水在紅外光譜中有極強(qiáng)的吸收，而且吸收峰的位置和蛋白質(zhì)的酰胺紅外吸收特征峰重合。為了克服這個局限，研究者開發(fā)了衰減全反射（Attenuated total reflection，ATR）技術(shù)[12]，利用紅外光可以在晶體中發(fā)生全反射的物理現(xiàn)象，獲得在晶體表面上附著的樣品的紅外信號，是一種表面分析技術(shù)。紅外光是一種電磁波，在ATR晶體表面上形成倏逝波（Evanescent wave），從而進(jìn)入表面上的樣品一定深度，獲得樣品信息。由于表面上的水含量相對溶液中大大降低，因此，水對于樣品的紅外光譜影響也大大降低，可以通過軟件處理進(jìn)行消除。

胃蛋白酶是由哺乳動物胃部的胃蛋白酶原在酸性條件下迅速轉(zhuǎn)化形成[13]，通過水解特定類型氨基酸之間的肽鍵，分解食物中的蛋白質(zhì)，是消化系統(tǒng)中非常重要的蛋白水解酶[14]。胃蛋白酶主要存在于胃液中，其活性與pH值相關(guān)，在pH 5.0時仍具有蛋白水解活性[15]。

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能需要多肽鏈正確的折疊和足夠的穩(wěn)定性，然而在溶劑類型、離子強(qiáng)度等外界環(huán)境因素的影響下，蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，甚至完全失活變性。胃蛋白酶的活性與周圍環(huán)境的酸堿度密切相關(guān)，而胃蛋白酶活性是由自身的結(jié)構(gòu)決定的。本研究考察了pH值對胃蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的影響。采用FTIR-ATR技術(shù)獲取胃蛋白酶的光譜，胃蛋白酶附著在ATR晶體表面上，表面上的官能團(tuán)有可能會影響胃蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)。本研究構(gòu)建了一個TiO2表面，在水溶液中負(fù)載大量的羥基基團(tuán)，這些羥基基團(tuán)電離后，所攜帶的負(fù)電荷密度會隨pH值的改變而改變，因此，對胃蛋白酶在TiO2表面上粘附時二級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了研究。通過研究胃蛋白酶在pH值變化過程中的二級結(jié)構(gòu)變化情況，可以了解胃蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式，闡明其生物活性與自身結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

MB3000系列傅立葉變換紅外光譜儀（ABB公司），配PN 022-19XX ATR附件，采用ZnSe ATR晶體（80 mm × 10 mm × 4 mm）; PHB-4型便攜式pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）; KQ3200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）; AR224CN電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）。

KBr（光譜純，美國PIKE公司）; 銳鈦型TiO2粉體（南京天行新材料有限公司）; 胃蛋白酶（Pepsin A，來源于家豬，EC號：232-629-3，酶活≧15000 NFU/m，生工生物工程（上海）股份有限公司）。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2?實驗方法

2.2.1?胃蛋白酶樣品溶液配制?將200 mg 胃蛋白酶粉末加入20 mL去離子水中，超聲分散，得到10 mg/mL溶液。以稀HCl溶液（pH 1）和NaOH溶液（pH 13）調(diào)節(jié)胃蛋白酶溶液的pH值，得到7組不同pH值的胃蛋白酶樣品溶液，用于紅外光譜采集。

2.2.2?ZnSe ATR晶體表面TiO2涂層的制備?將30 mg 銳鈦型納米TiO2（平均粒徑為10 nm）充分分散在25 mL無水乙醇中，獲得TiO2 懸濁液。將400 μL懸濁液滴在ATR晶體表面，使其均勻展開，當(dāng)無水乙醇完全揮發(fā)后，以氮氣吹掃掉表層的粉末，獲得穩(wěn)定的TiO2涂層，經(jīng)計算，涂層厚度約為100 nm。

2.2.3?胃蛋白酶紅外光譜測試?胃蛋白酶粉末的紅外譜圖將采用KBr壓片法獲得。將1 mg胃蛋白酶粉末與1 g KBr在研缽中充分研磨，取0.5 g壓成直徑13 mm的透明片狀樣品，以空氣為背景，測定紅外光譜。胃蛋白酶溶液的紅外光譜采用ATR的方法獲得。將2 mL胃蛋白酶溶液加入ATR液體池，以水為背景，測定其紅外光譜。采用同樣方法獲得胃蛋白酶在TiO2涂層上的紅外光譜。

光譜采集波數(shù)范圍為4000～400 cm1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為4 cm1，每隔10 min采集一次光譜，共采集12次，每次實驗持續(xù)時間為2 h。為了保證紅外光譜儀的正常運(yùn)行和光譜數(shù)據(jù)的一致性，環(huán)境溫度保持為18℃～28℃，濕度為50%～75%[16]?。

2.2.4?紅外光譜數(shù)據(jù)處理?獲得的紅外光譜采用GRAMS/AI 9.2軟件進(jìn)行處理。由于H2O在光譜區(qū)域1640 cm1附近有強(qiáng)吸收，與蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ吸收峰有重疊，所以，每個光譜都進(jìn)行了水和水氣的消減。胃蛋白酶的光譜經(jīng)過二階導(dǎo)數(shù)計算，對1700～1600 cm1的吸收峰進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得到各吸收峰面積，用于考察胃蛋白酶蛋白質(zhì)骨架上的二級結(jié)構(gòu)成分在pH值影響下的變化。

3?結(jié)果與討論

3.1?胃蛋白酶在粉末和溶液狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)對比變化

由于所處外界環(huán)境的不同，空氣中的粉末狀胃蛋白酶和水環(huán)境中的胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)可能有所不同。圖1為胃蛋白酶粉末、胃蛋白酶溶液在ZnSe ATR晶體表面和胃蛋白酶在TiO2涂層的ATR表面上的紅外光譜圖。光譜中展示的胃蛋白酶是未調(diào)節(jié)pH值的樣品。在無涂層的ZnSe ATR晶體表面上，胃蛋白酶溶液的pH=3.62，在納米TiO2表面上pH=3.10。胃蛋白酶的pH值的微小變化可能是由于TiO2表面上的羥基在水中微弱電離帶來的額外的H+造成的。

在胃蛋白酶KBr壓片紅外光譜（圖1A）中，3700～2840 cm1區(qū)域出現(xiàn)了一個很寬的吸收譜帶。這主要是胃蛋白酶吸收了空氣中微量的水，H2O的對稱和反對稱伸縮振動和胃蛋白酶中酰胺鍵的NH伸縮振動的吸收峰由于形成氫鍵而變寬，主峰大約位于3300～3200 cm1之間。在胃蛋白酶溶液中，由于胃蛋白酶取代H2O分子占據(jù)了部分的ATR晶體表面，所以H2O的特征峰為負(fù)值。3000～2840 cm1的吸收峰主要是CH3、CH2的對稱和反對稱伸縮振動引起。由圖1A可見，在納米TiO2表面，CH3和CH2的峰特別明顯，這是因為此時胃蛋白酶在水中帶有負(fù)電荷，而TiO2帶有正電荷，在靜電力和氫鍵的作用下，胃蛋白酶更多地吸附在表面上，因此在ATR光譜上可以看到更多的烷烴特征基團(tuán)。

由圖1B可見，在溶液狀態(tài)下，胃蛋白酶在1725 cm1附近出現(xiàn)了羧酸羰基CO的伸縮振動峰[17]。這是因為溶液pH≈3～4，肽鏈兩端及側(cè)鏈上有很多的游離羧基與溶液中的H+結(jié)合，形成了COOH基團(tuán)。KBr壓片、無涂層的ATR表面和TiO2涂層的ATR表面上的胃蛋白酶的酰胺Ⅰ帶的位置分別為1654、1634和1631 cm1，有明顯的紅移趨勢。由于蛋白質(zhì)多肽鏈中羰基氧原子大多與亞氨基氫原子形成氫鍵，所以當(dāng)H2O存在時，H2O分子會破壞原有的氫鍵，取而代之的是作用力更強(qiáng)的羰基CO與H2O分子間的氫鍵。相比之下，CO間的電子云密度下降，酰胺Ⅰ發(fā)生紅移。當(dāng)晶體表面覆蓋一層TiO2時，TiO2表面上的部分羥基和H2O分子競爭，與羰基CO形成氫鍵，所以此時的酰胺Ⅰ帶進(jìn)一步發(fā)生紅移。同理，當(dāng)肽鍵中的CO與NH之間的氫鍵作用減弱的同時，多肽鏈中的CNH彎曲振動頻率增大，酰胺Ⅱ發(fā)生藍(lán)移[6]，因此會發(fā)生如圖1B中的1539、1545和1547 cm1的譜帶峰位變化。

通常情況下，蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)產(chǎn)生9個振動譜帶[18]，選擇其中的酰胺Ⅰ（1700～1600 cm1）作為研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)分析對象，酰胺Ⅰ是由多肽鏈骨架振動產(chǎn)生的一個強(qiáng)譜帶，對羰基的幾何振動和氫鍵結(jié)構(gòu)都非常敏感[19]，因此對于二級結(jié)構(gòu)的研究有很大價值。酰胺Ⅰ中不同的子峰對應(yīng)不同的二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)文獻(xiàn)[11，20]對各個子峰進(jìn)行了歸屬，結(jié)果見表1。

對酰胺Ⅰ進(jìn)行二階求導(dǎo)和高斯函數(shù)擬合，得到胃蛋白酶中各個二級結(jié)構(gòu)的相對含量關(guān)系，如圖2所示。

曲線擬合結(jié)果見表2。在溶液狀態(tài)下，胃蛋白酶在ATR晶體表面以及納米TiO2表面的β-折疊結(jié)構(gòu)分別增加了23%和34%，同時α-螺旋結(jié)構(gòu)減少了16%和26%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)也下降了11%與15%，這表明在H2O的作用下，胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)變得更加有序緊密; 另外，TiO2表面上的β-折疊結(jié)構(gòu)含量更多，這是因為TiO2的存在使得不同肽鏈或同一肽鏈不同肽段間形成氫鍵所致。

3.2?胃蛋白酶在不同pH值下的結(jié)構(gòu)變化

不同pH值下的紅外光譜（圖3A）表明，在1724 cm1附近出現(xiàn)了一個較小的特征吸收譜帶，為多肽鏈C端或者是側(cè)鏈游離羧基上的羰基CO伸縮振動峰。隨著pH值增大，1724 cm1處的峰漸漸消失，1399 cm1處的羧酸根反對稱伸縮振動譜帶從無到有，逐漸增大，這是因為隨著pH值升高，羧基逐步解離，以羧酸根形式存在。1634和1545 cm1處的峰是胃蛋白

酶的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰，各pH值條件下峰的位置無明顯變化，說明pH值未對多肽鏈骨架上羰基CO和氨基NH間的氫鍵產(chǎn)生影響。1455 cm1處的峰對應(yīng)于CH3的不對稱變角振動和CH2的變角振動，1242 cm1代表的是酰胺Ⅲ，1081 cm1是COH的伸縮振動譜帶。

采用紅外光譜測得的胃蛋白酶中的各種二級結(jié)構(gòu)與pH值的關(guān)系如圖3B所示，隨著pH值升高，胃蛋白酶結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)增加，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)減少，表明此時肽鏈中形成了更多的氫鍵，屬于變性過程中的中間態(tài)，仍具有部分的生物活性。隨著pH值進(jìn)一步增加，β-片層和螺旋結(jié)構(gòu)這兩種規(guī)則有序結(jié)構(gòu)迅速減少，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角呈明顯增加的趨勢，這是因為在堿性狀態(tài)下胃蛋白酶趨于完全變性，多肽鏈開始解折疊，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)無序松散的狀態(tài)，已完全失去了原有的催化活性。

3.3?TiO2表面上的胃蛋白酶在不同pH值下的結(jié)構(gòu)變化

圖4A是TiO2表面上胃蛋白酶在不同pH值下的紅外光譜，1725、1631、1547、1466和1402 cm1處分別出現(xiàn)了羧基上的羰基CO、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、CH3和CH2的變角振動及羧酸根反對稱伸縮振動的紅外吸收峰。如前所述，TiO2使酰胺Ⅰ發(fā)生紅移，肽鍵羰基CO的氧原子電子云密度降低，使得側(cè)鏈上的CH3、CH2基團(tuán)的電子云密度升高，所以圖4A中可見其特征吸收峰由1455 cm1移至1466 cm1，向高波數(shù)方向移動了11 cm1; 同理，酰胺ⅢCN的伸縮振動峰也從1242 cm1處移到1261 cm1附近，COH伸縮振動的吸收峰從1081 cm1藍(lán)移到1092 cm1。并且，在TiO2表面上的吸收峰強(qiáng)度明顯高于沒有涂層的ZnSe ATR晶體，說明在靜電力和氫鍵的作用下，更多的胃蛋白酶粘附在TiO2表面上。

由圖4B可見，胃蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)變化與圖3B不同，在各個pH值下的胃蛋白酶中的β-折疊結(jié)構(gòu)含量都很高，隨著pH值增大，總體呈微弱下降趨勢，說明TiO2保持和增強(qiáng)了β-折疊結(jié)構(gòu)中的氫鍵，使其不易發(fā)生解體; 同時，β-折疊含量遠(yuǎn)高于其它3種二級結(jié)構(gòu)的含量，而其它二級結(jié)構(gòu)在pH值變化的過程中含量均沒有明顯的變化，在此種情況下，胃蛋白酶中的空間結(jié)構(gòu)非常致密緊實，更具有剛性。采用圓二色譜（CD）研究蛋白質(zhì)在石墨烯上的構(gòu)象變化[21]，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)附著在石墨烯上，其構(gòu)象變化較大，盡管在環(huán)境中存在石墨烯，未附著的蛋白質(zhì)構(gòu)象也沒有明顯變化，與本研究結(jié)果相吻合。

4?結(jié) 論

測定了胃蛋白酶的紅外光譜，發(fā)現(xiàn)酰胺I帶的紅移和酰胺II帶的藍(lán)移，并發(fā)現(xiàn)在溶液狀態(tài)下，胃蛋白酶的β-折疊含量增加，a-螺旋含量降低。隨著pH值的增加，胃蛋白酶溶液的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的吸收峰位置位發(fā)生明顯變化，羧基中的羰基CO吸收峰逐漸消失，羧酸根反對稱伸縮振動的吸收峰逐漸增大，β-折疊結(jié)構(gòu)含量先增加后減少，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量先減少后增加。在TiO2表面上時，胃蛋白酶溶液的紅外譜圖中出現(xiàn)了強(qiáng)的COH伸縮振動峰，二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊結(jié)構(gòu)比例維持在較高水平，隨著pH值的增高而緩慢下降。對比胃蛋白酶溶液在無涂層的ATR和帶有TiO2涂層的ATR表面上的紅外光譜吸收峰強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，TiO2的存在有利于溶液中胃蛋白酶的吸附。

References

1?YAN Long-Fei，SUN Zhi-Rong. The Structure of Protein Molecule. Beijing： Tsinghua University Press，1999： 2

閻隆飛，孫之榮. 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，北京： 清華大學(xué)出版社，1999： 2

2?Guo C E，Guo X M，Chu W B，Jiang N，Li H. Chin. Chem. Lett.，2019，30（6）： 1302-1306

3?Rogers D M，Jasim S B，Dyer N T，Auvray F，Refregiers M，Hirst J D. Chem，2019，5（11）： 2751-2774

4?Friedrich D，Perodeau J，Nieuwkoop A J，Oschkinat H. J. Biomol. NMR，2020，74（4-5）： 247-256

5?Scholliers J，Steen L，Glorieux S，van de Walle D，Dewettinck K，F(xiàn)raeye I. Food Res. Int.，2019，122： 411-418

6?Krimm S，Bandekar J. Adv. Protein Chem.，1986，38： 181-364

7?Surewicz W K，Mantsch H H. Biochim. Biophys. Acta，1988，952（2）： 115-130

8?LIU Xiao，TANG Wen-Ting，LI Qian，YUE Ming. Spectroscopy and Spectral Analysis，2011，31（1）： 65-68

劉 曉，唐文婷，李 倩，岳 明. 光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（1）： 65-68

9?Susi H，Byler D M. Methods Enzymol.，1986，130： 290-311

10?Guo C E，Guo X M，Chu W B，Jiang N，Li H. Chin. Chem. Lett.，2020，31（1）： 150-154

11?Kong J L，Yu S N. Acta Biochim. Biophys. Sin.，2007，39（8）： 549-559

12?Smith B C. Fundamentals of Fourier Transform Infrared Spectroscopy. CRC Press，1995： 208

13?Kageyama T. Cell. Mol. Life Sci.，2002，59（2）： 288-306

14?Rho Y，Kim J H，Min B，Jin K S. Polymers，2019，11（12）： 2104

15?Ciolkowski M，Rozanek M，Bryszewska M，Klajnert B. BBA-Proteins Proteomics，?2013，1834（10）： 1982-1987

16?GB/T 6040-2002，General Rules for Infrared Analysis. National Standards of the People′s Republic of China

紅外光譜分析方法通則. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 6040-2002

17?Chen R Q，Guo C E，Chu W B，Jiang N，Li H. Chin. Chem. Lett.，2019，30（1）： 115-119

18?Zhao J，Wang J P. J. Phys. Chem. B，2016，120 （36）： 9590-9598

19?ZHANG Jian，WANG Ya-Yun，HU Guang-Fu，LI Meng-Qin. Cereal & Feed Industry，2017，6： 14-18

張 劍，王亞運(yùn)，胡廣甫，李夢琴. 糧食與飼料工業(yè)，2017，6： 14-18

20?Rocha L F O. J. Mol. Struct.，2014，1063： 242-250

21?Wei S，Zou X Q，Tian J Y，Huang H，Guo W，Chen Z. J. Am. Chem. Soc.，2019，141（51）： 20335-20343