原核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控與產(chǎn)物純化綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與教學(xué)實(shí)踐

李 欣， 趙玉紅， 趙立青， 李小菊， 張偉英， 石建黨

（南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津300071）

0 引 言

基因表達(dá)調(diào)控是指生物體內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)控制，使細(xì)胞中基因表達(dá)的過程在時間、空間上處于有序狀態(tài)，并對環(huán)境條件的變化作出反應(yīng)的復(fù)雜過程［1］。對于真核生物而言，基因表達(dá)調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄前水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平等的調(diào)控，而原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)簡單，轉(zhuǎn)錄和翻譯可以在同一時間和位置上發(fā)生，其基因表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上，而原核表達(dá)的主要目的多是為獲得高純度的靶蛋白。基因表達(dá)調(diào)控是生物體內(nèi)細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生和個體發(fā)育的分子基礎(chǔ)，作為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的中心課題之一，一直是高校生物學(xué)科理論與實(shí)踐教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)［2-4］。

為此，生物國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（以下簡稱“中心”）分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程組設(shè)計(jì)了“原核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控與產(chǎn)物純化綜合實(shí)驗(yàn)”，并應(yīng)用于大三年級生物伯苓班開設(shè)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程，作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的補(bǔ)充與拓展。實(shí)驗(yàn)以原核細(xì)胞模式生物——大腸桿菌為研究對象，首先利用實(shí)時定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上分析IPTG對啟動子活性的調(diào)節(jié)作用，同時利用免疫印跡技術(shù)檢測目的蛋白受IPTG 的誘導(dǎo)表達(dá)情況，并最終通過親和層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由教師科研成果轉(zhuǎn)化而來，集綜合性和探索性于一身，在幫助學(xué)生夯實(shí)基礎(chǔ)理論的同時，更加注重培養(yǎng)學(xué)生運(yùn)用所學(xué)知識分析問題解決問題的能力，進(jìn)而為優(yōu)化分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，提高生命科學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量做出了積極嘗試［5］。

1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)；常規(guī)PCR 儀；RocheLightCycler 480 實(shí)時定量PCR儀；NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)；六一水平電泳裝置；Bio-Rad 垂直電泳裝置；Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽；Bio-Rad PowerPac HC高電流電泳儀；金屬?。缓銣卣袷幣囵B(yǎng)箱；GeneSys Chemi：XR5 凝膠成像系統(tǒng)；超聲破碎儀等。

2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

轉(zhuǎn)化有pGEX-4T-2 ／ GAPDH 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α；RNAprepPure細(xì)菌總RNA提取試劑盒；DNase ／RNase-FreeDeionized Water；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit；LightCycler 480 SYBRGreen ⅠMaster；誘導(dǎo)物IPTG；TE Buffer（pH 8． 0）；實(shí)時定量PCR 目的基因擴(kuò)增引物（上游： 5 ’-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3 ’； 下游： 5 ’-CTGGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’）；實(shí)時定量PCR 內(nèi)參基因擴(kuò)增引物（上游： 5 ’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3 ’； 下游： 5 ’-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3’）。

30%丙烯酰胺凝膠貯液；分離膠緩沖液（1． 5 mol／L Tris-HCl，pH8． 8）；濃縮膠緩沖液（0． 5 mol／ L Tris-HCl，pH6． 8）；10% SDS；10% AP；TEMED；1 × 電泳緩沖液；2 × SDS-PAGE上樣緩沖液；預(yù)染Marker；電轉(zhuǎn)移緩沖液；100% 甲醇；PVDF 膜；Whatman 3MM 濾紙；PBST；封閉液（5%脫脂奶粉）；鼠源抗GST 抗體；自制的大腸桿菌內(nèi)源GAPDH 抗體；辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗鼠IgG；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒；Lysis Buffer；1 × PBS溶液；含30mM GSH 的Tris-HCl（pH8． 0）；GE 親和填料Glutathione Sepharose 4B等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)化有pGEX-4T-2 ／ GAPDH質(zhì)粒的大腸桿菌接種于適量含有80 μg ／ mL氨芐西林的LB 培養(yǎng)基中，37℃，200 r／ min振蕩培養(yǎng)，至OD600達(dá)0． 6 ～0． 8 h，分為兩組，其中一組不加IPTG（對照組），另一組加入IPTG至終濃度為1 mmol／ L（誘導(dǎo)組），37 ℃，200 r／ min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。

3.2 大腸桿菌總RNA的提取

以RNAprepPure細(xì)菌總RNA 提取試劑盒說明書為準(zhǔn)。

3.3 RNA檢測

3.3.1 定量檢測

滴加2 μL 待測RNA 于NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)基座上進(jìn)行定量。

3.3.2 定性檢測

上樣4 μg待測RNA進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，80 V，30 min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

3.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按表1 配制反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄條件設(shè)定為：25℃，10 min；42 ℃，60 min；80 ℃，10 min；4 ℃，forever。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

3.5 實(shí)時定量PCR

按表2 配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)定見表3。

表2 實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系

表3 實(shí)時定量PCR反應(yīng)程序

3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlotting）

3.6.1 SDS-PAGE

在1． 5 mL離心管中加入100 μL 菌液，12 000 r／min離心1 min，棄去上清，收集菌體，在沉淀中加入100 μL PBS 溶液，充分混勻后再加入等量的2 × SDSPAGE上樣緩沖液，混勻后金屬浴上100 ℃加熱20min，并且每隔幾分鐘輕彈盛裝樣品的離心管底部，保證菌體裂解充分；14 000 r／ min 離心5 min，上清液作為SDS-PAGE 的樣品上樣。所用Marker 為預(yù)染Marker。電泳電壓120 V，時間1 h。

3.6.2 電泳轉(zhuǎn)印

（1）根據(jù)Marker條帶將凝膠切成理想大小，剪好同等大小的濾紙和PVDF膜；

（2）將PVDF膜放入100%甲醇中浸泡1 ～2 min；

（3）將凝膠、濾紙和PVDF 膜放入電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡；

（4）在Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽中組裝“三明治”結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印槽連接電泳儀，10 V 轉(zhuǎn)印30 min。

3.6.3 抗體雜交

（1）將PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉45 min，PBST洗膜，根據(jù)不同目的蛋白位置剪膜，以便孵育不同抗體；

（2）分別孵育鼠源抗GST 抗體和自制的大腸桿菌內(nèi)源GAPDH抗體（1∶5 000 PBST稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜；

（3）孵育HRP偶聯(lián)羊抗鼠IgG（1∶10 000 PBST稀釋），室溫孵育45 min，PBST洗膜。

3.6.4 成像檢測

（1）將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A液和B液1∶1配制，PVDF膜上孵育1 min后棄去；

（2）將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)，CCD成像。

3.7 蛋白質(zhì)親和純化

3.7.1 樣品制備

（1）收集菌體：將20 ℃1 mmol／ L IPTG誘導(dǎo)過夜的大腸桿菌4 ℃6 000 r／ min離心15 min，共收集250 mL菌體；

（2）超聲破碎：用20 mL lysis buffer 重懸菌體漩渦混勻后置于冰水混合物中，超聲功率調(diào)至200 W，超聲5 s，間歇5 s，循環(huán)25 次，直至菌液漸澄清（超聲前后分別對全菌、沉淀和上清留樣，處理方法同3． 6． 1）；

（3）獲得樣品：將超聲裂解液4 ℃14 000 r／ min離心30 min，上清經(jīng)0． 45 μm濾膜過濾即獲得樣品。

3.7.2 親和純化

（1）將GE親和填料1 mL 裝入層析柱，用10 倍柱體積的ddH20 洗滌；

（2）用10 倍柱體積的PBS溶液平衡柱子；

（3）將離心得到的上清液加入柱子，堵上堵頭，使上清與填料4 ℃旋轉(zhuǎn)混合1 h；

（4）將堵頭去掉，填料自然沉降，收集流穿液；

（5）用5 倍柱體積PBS 過柱子洗雜，收集洗雜液（每毫升依次取樣）；

（6）用3 倍柱體積含有30 mmol／ L GSH 的PBS溶液洗脫，收集洗脫液（每毫升依次取樣）；

（7）將上述收集液分別與2 × loading buffer 混合煮樣后離心，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 轉(zhuǎn)錄水平上分析IPTG 對啟動子活性的調(diào)節(jié)作用

4.1.1 大腸桿菌總RNA的提取與檢測按實(shí)驗(yàn)方法3． 1 將大腸桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h 后，對照組和誘導(dǎo)組分別提取總RNA，并進(jìn)行定量檢測，結(jié)果如圖1 所示。圖1 表明，提取的大腸桿菌總RNA濃度較好，分別為532． 1 ng ／ μL（對照組）和754． 0 ng ／ μL（誘導(dǎo)組），但A260 ／ A280 比值略高于2． 0，說明提取純度不甚理想，可能是試劑殘留或RNA部分降解造成的。為此還需進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA 的提取質(zhì)量進(jìn)行定性檢測，結(jié)果如圖2。

大腸桿菌總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，理論上應(yīng)該看到23S、16S 和5SrRNA3 條帶。根據(jù)圖2 結(jié)果中的條帶數(shù)量、帶型和亮度，說明總RNA 的提取質(zhì)量良好。

圖1 大腸桿菌總RNA定量檢測結(jié)果（上：對照組；下：誘導(dǎo)組）

圖2 大腸桿菌總RNA 定性檢測結(jié)果（左泳道：對照組；右泳道：誘導(dǎo)組）

4.1.2 實(shí)時定量PCR分析IPTG對啟動子活性的調(diào)節(jié)作用

對提取的對照組和誘導(dǎo)組RNA 按實(shí)驗(yàn)方法3． 4進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA分別作為實(shí)時定量PCR 模板，對內(nèi)參基因即大腸桿菌內(nèi)源16SrRNA，和目的基因即外源GST-GAPDH 按實(shí)驗(yàn)方法3． 5 各自進(jìn)行擴(kuò)增，引物與模板對應(yīng)關(guān)系如表4 所示，共4 組反應(yīng)，每組反應(yīng)3 個重復(fù)，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)較為完好的“S”形（見圖3），符合定量檢測要求。

表4 實(shí)時定量PCR各組模板與引物對應(yīng)關(guān)系

圖3 實(shí)時定量PCR擴(kuò)增曲線

本實(shí)驗(yàn)選用染料法，因此需要通過各擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線來考察產(chǎn)物的特異性，如圖4 所示。從圖中可以看出，讀板溫度設(shè)為78 ℃時，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分別在目的基因和內(nèi)參基因Tm 處只有單一峰，表示擴(kuò)增特異性良好，無非特異性擴(kuò)增。

圖4 擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線

在此基礎(chǔ)上選擇相對定量分析模式，誘導(dǎo)組經(jīng)過對照組均一化處理，計(jì)算結(jié)果如表5 所示。

表5 實(shí)時定量PCR相對定量結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)內(nèi)參基因校正后，誘導(dǎo)組目的基因mRNA水平是對照組的5． 603 倍，即經(jīng)過1 mmol／ L IPTG誘導(dǎo)后，在轉(zhuǎn)錄水平上啟動子活性即利用效率明顯提高，是未經(jīng)誘導(dǎo)時的5． 603 倍。

4.2 翻譯水平上檢測目的蛋白受IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)

按實(shí)驗(yàn)方法3． 1 將大腸桿菌同樣誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h后，按實(shí)驗(yàn)方法3． 6 進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在一抗孵育前，將PVDF膜上下剪開，上膜用鼠抗GST抗體對外源目的蛋白GST-GAPDH 進(jìn)行檢測，下膜用自制的大腸桿菌內(nèi)源GAPDH抗體對內(nèi)參蛋白GAPDH進(jìn)行檢測，CCD系統(tǒng)成像結(jié)果如圖5 所示。

免疫印跡結(jié)果表明，經(jīng)過1 mM IPTG 誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)組外源目的蛋白GST-GAPDH的表達(dá)量明顯高于對照組，且內(nèi)參蛋白GAPGH 的檢測證明這種差異并非由上樣量不均而引起，說明IPTG 的誘導(dǎo)可在翻譯水平上顯著提高目的蛋白表達(dá)量。值得一提的是，理論上目的蛋白和內(nèi)參蛋白可以用相同的GAPDH 抗體檢出，但因兩種蛋白來源上的差異，本實(shí)驗(yàn)選擇了兩種不同的抗體來保證檢測效果。

圖5 免疫印跡CCD系統(tǒng)成像結(jié)果

4.3 目的蛋白親和純化

按實(shí)驗(yàn)方法3． 7 對靶蛋白GST-GAPDH 進(jìn)行親和純化，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 親和純化結(jié)果

從泳道1 ～3 可見，目的蛋白表達(dá)量較高，且可溶性蛋白居多；泳道4 ～6 表明目的蛋白純化效果良好，幾乎無雜蛋白；但因親和填料飽和或與蛋白作用不充分，導(dǎo)致7 ～9 泳道即流穿液中也有較多目的蛋白，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需增加填料，或延長填料與蛋白孵育時間。

5 實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)與實(shí)踐

5.1 課堂教學(xué)

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容綜合性和連貫性強(qiáng)，對于本科生而言，操作難度大，失誤率高，為不增加學(xué)生負(fù)擔(dān)的同時保障教學(xué)效果，實(shí)驗(yàn)首先面向?qū)W有余力的大三年級生物伯苓班開設(shè)?！安甙唷笔悄祥_大學(xué)入選的國家“基礎(chǔ)學(xué)科拔尖學(xué)生培養(yǎng)試驗(yàn)計(jì)劃”的生物學(xué)科人才培養(yǎng)試點(diǎn)班。大三年級生物伯苓班學(xué)生已經(jīng)具備分子生物學(xué)理論和操作基礎(chǔ)，且均有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室參與科研活動的經(jīng)歷，因此，將本項(xiàng)目作為綜合性實(shí)驗(yàn)開設(shè)，學(xué)生探索為主，教師指導(dǎo)為輔，以科研微課題的形式讓學(xué)生自主安排時間完成。過程中任課教師定期組織教學(xué)討論，并隨時答疑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要求學(xué)生以科研論文的形式撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示與匯報(bào)。任課教師綜合過程表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和展示情況給出最終成績。上述教學(xué)模式充分突出了學(xué)生的學(xué)習(xí)主體地位，旨在充分激發(fā)學(xué)生的科研興趣，著重培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析問題、解決問題的科學(xué)思維和實(shí)踐能力［6-7］，受到伯苓班學(xué)生的廣泛認(rèn)可與好評。

5.2 實(shí)踐拓展

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是對基礎(chǔ)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的補(bǔ)充與延伸，因此對于其他涉及分子生物學(xué)學(xué)習(xí)的專業(yè)來說同樣具有實(shí)踐價值。但由于受到學(xué)時有限、實(shí)驗(yàn)成本較高、學(xué)生基礎(chǔ)參差不齊等諸多因素的限制［8-9］，擴(kuò)大本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的課堂教學(xué)受眾面尚有一定困難。為此，課程組將其中的關(guān)鍵部分通過虛擬仿真技術(shù)呈現(xiàn)出來，除了模擬按部就班的實(shí)驗(yàn)操作以外，還著重突出了如下兩點(diǎn)：一是將實(shí)驗(yàn)涉及的理論和技術(shù)原理制作成3D動畫（見圖7 ～10），通過動畫的生動演示將微觀變?yōu)榭梢暎瑢⒊橄笞優(yōu)橹庇^，將靜態(tài)變?yōu)閯討B(tài)，能夠有效幫助學(xué)生理解相應(yīng)知識點(diǎn)；二是在多個實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中設(shè)計(jì)了常規(guī)教學(xué)無法平行開展的多樣化實(shí)驗(yàn)方法以達(dá)到同一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，使學(xué)生在充分體驗(yàn)“條條大路通羅馬”的同時拓展實(shí)驗(yàn)思路，如Western Blotting部分中，電泳轉(zhuǎn)印除了實(shí)驗(yàn)中用到的半干轉(zhuǎn)，還有濕轉(zhuǎn)法（見圖11），而蛋白質(zhì)親和純化除了填料法以外，蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)配合預(yù)裝柱同樣是科研中的常用手段（見圖12）。采用虛實(shí)結(jié)合的教學(xué)模式，不僅可以拓展實(shí)驗(yàn)本身的廣度和深度，尤其對于尚無條件開展完整實(shí)驗(yàn)的相關(guān)院校和專業(yè)，更能夠有效彌補(bǔ)實(shí)體實(shí)驗(yàn)教學(xué)的不足，促進(jìn)教學(xué)質(zhì)量的提升［10-11］。

圖7 “基因表達(dá)調(diào)控”原理動畫界面

圖8 “Western Blot”原理動畫界面

圖9 “實(shí)時定量PCR”原理動畫界面

圖10 “目的蛋白親和純化”原理動畫界面

圖11 電泳轉(zhuǎn)?。ㄗ螅簼褶D(zhuǎn)；右：半干轉(zhuǎn)）

圖12 蛋白純化（左：填料法；右：蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)）

6 結(jié) 語

基因表達(dá)調(diào)控是分子生物學(xué)教學(xué)任務(wù)中的重要組成部分，讓學(xué)生深入理解其基本內(nèi)容，形成分子生物學(xué)基本思維方式和研究方法是教學(xué)實(shí)踐的重要目標(biāo)［12-13］。為此，中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程組設(shè)計(jì)了“原核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控與產(chǎn)物純化綜合實(shí)驗(yàn)”作為對基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)是在1 mmol／ LIPTG誘導(dǎo)下對大腸桿菌轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平分別進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)，大腸桿菌啟動子活性明顯提高，目的蛋白表達(dá)量顯著增加，并可通過親和層析獲得純度較高的靶蛋白。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上環(huán)環(huán)相扣，不僅讓學(xué)生掌握基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的常用實(shí)驗(yàn)方法，提高學(xué)生的動手實(shí)踐能力，更培養(yǎng)了學(xué)生系統(tǒng)的科研思維以及嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴仞B(yǎng)。在教學(xué)實(shí)踐中，實(shí)驗(yàn)以實(shí)體課堂授課模式為主線，并輔以虛擬仿真技術(shù)，可滿足不同學(xué)習(xí)條件、學(xué)習(xí)基礎(chǔ)和學(xué)習(xí)需求的受眾，對于增強(qiáng)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)意識，推進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式多樣化，提高本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平和人才培養(yǎng)質(zhì)量發(fā)揮了積極作用［14-16］。