可溶性HLA-G和Toll樣受體2、Rta基因在傳染性單核細(xì)胞增多癥中的表達(dá)及相關(guān)性分析

韓紅滿，秦偉，左立輝，劉貴敏，李四強(qiáng)

傳染性單核細(xì)胞增多癥屬于一種較為常見的感染性疾病，好發(fā)于兒童時期，由EB病毒(EBV)感染所致的全身免疫異常性疾病，此病主要特征表現(xiàn)為發(fā)熱、肝、脾、淋巴結(jié)腫大、咽頰炎、外周血異型淋巴細(xì)胞增多等[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[2]，B細(xì)胞為原發(fā)性EBV感染的初始靶細(xì)胞，當(dāng)B細(xì)胞被病毒感染后，會經(jīng)自身特定抗原表達(dá)，之后經(jīng)病毒基因、病毒編碼產(chǎn)物對細(xì)胞基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，最終引發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥。近年來，傳染性單核細(xì)胞增多癥的發(fā)病率顯著上升，且呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，但目前對于此病發(fā)生的具體機(jī)制尚不完全明確[3]。為尋找早期診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥的特異性指標(biāo)，本研究選取醫(yī)院收治的傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒，檢測可溶性人類白細(xì)胞抗原-G(sHLA-G)、Toll樣受體2(TLR2)、Rta的表達(dá)，并分析其相關(guān)性，明確三者是否參與此病的發(fā)生發(fā)展，為其診斷提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院血液內(nèi)分泌科診治EBV感染所致的傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒80例作為觀察組，男44例，女36例，年齡2～11(6.3±3.8)歲；病程3～28(15.5±10)d；病理分期[4]：前期25例，中期34例，后期16例，末期5例。另外選取同期于醫(yī)院行健康體檢的健康兒童80例作為健康對照組，男38例，女42例，年齡2～12(6.5±4.4)歲。2組研究對象在性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組符合EBV感染傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、咽炎、扁桃體炎、頸部淋巴結(jié)、肝脾腫大；初次發(fā)病；外周血異型淋巴細(xì)胞陽性、血清嗜異性凝集試驗(yàn)陽性和EB陽性；均未接受疾病相關(guān)治療；近半年無病毒感染史、無合并癥。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：免疫調(diào)節(jié)劑使用史者；細(xì)胞毒性藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物濫用史者；免疫缺陷病者；噬血細(xì)胞綜合征者；其他病毒感染者；精神障礙者；心肺功能不全者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血漿sHLA-G檢測：采集2組研究對象入院次日和觀察組患兒進(jìn)入恢復(fù)期清晨空腹靜脈血6 ml EDTA抗凝，3 ml離心取血漿，-80℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法檢測sHLA-G水平，將血漿置于室溫后，取出試劑盒，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測血清及標(biāo)準(zhǔn)品100 μl /孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl /孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl /孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl /孔，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值，分析sHLA-G水平。

1.3.2 TLR2、Rta mRNA檢測：應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)法，取上述血液3 ml，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離得單個核細(xì)胞，提取總RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer 5.0軟件對引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用2-△△Ct方法計(jì)算出外周血單個核細(xì)胞中TLR2、Rta表達(dá)量；TLR2引物序列：上游5’-ATTGTGCCCATTGCTCTTTC-3’，下游5’-CTTCCTTGGAGAGGCTGATG-3’；Rta引物序列：上游5’-AATTTACAGCCGGGAGTGTG-3’，下游5’-AGCCCGTCTTCTACCCTGT-3’；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

2 結(jié) 果

2.1 2組sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA 表達(dá)比較 觀察組sHLA-G表達(dá)水平、TLR2 mRNA、Rta mRNA表達(dá)量均高于健康對照組 (P<0.01)，見表1。

表1 2組受試者sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表達(dá)比較

2.2 觀察組不同病理分期sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表達(dá)比較 傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表達(dá)量比較，前期<中期<后期<末期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 觀察組不同病理分期sHLA-G、TLR2、Rta表達(dá)比較

2.3 觀察組不同臨床分期sHLA-G、TLR2 mRNA、Rta mRNA表達(dá)比較 80例患兒經(jīng)規(guī)范治療后進(jìn)入恢復(fù)期，急性期傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒sHLA-G表達(dá)水平、TLR2 mRNA、Rta mRNA表達(dá)量均高于恢復(fù)期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 觀察組不同分期sHLA-G、TLR2、Rta 表達(dá)比較

2.4 各指標(biāo)間相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，sHLA-G與TLR2 mRNA、Rta mRNA呈正相關(guān)(r/P=0.404/0.001、0.240/0.032)，TLR2 mRNA與Rta mRNA亦呈正相關(guān)(r/P=0.271/0.015)，見圖1。

3 討 論

傳染性單核細(xì)胞增多癥發(fā)生后多數(shù)患者均表現(xiàn)為不同程度的免疫功能紊亂現(xiàn)象，人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)屬于一種免疫調(diào)節(jié)因子，主要包括可溶性HLA-G(sHLA-G)、膜結(jié)合型HLA-G(mHLA-G)2種表達(dá)形式[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，HLA與宿主免疫系統(tǒng)免疫應(yīng)答相關(guān)，在此過程中具有重要的意義，HLA-G屬于非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子，位于人6號染色體短臂上，最早在母胎界面絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)。目前臨床上已經(jīng)證實(shí)[8]，HLA-G具有抑制細(xì)胞因子釋放、NK細(xì)胞殺傷效應(yīng)、樹突狀細(xì)胞抗原遞呈、TH細(xì)胞輔助功能及CTL殺傷作用等功能，且上述功能均與病毒感染細(xì)胞免疫逃避相關(guān)。目前外周血sHLA-G已經(jīng)用于機(jī)體免疫耐受性的診斷中，EBV感染的傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒血漿sHLA-G水平與外周血淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系表明，sHLA-G在傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒血漿中異常高表達(dá)，且與機(jī)體免疫相關(guān)[9-10]?；谏鲜鲅芯浚诒狙芯恐蟹治鰏HLA-G與傳染性單核細(xì)胞增多癥的關(guān)系，結(jié)果顯示，sHLA-G在傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒血漿中高表達(dá)，且與患兒疾病分期、疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，提示sHLA-G參與傳染性單核細(xì)胞增多癥的發(fā)生發(fā)展，表現(xiàn)為異常高表達(dá)，與上述研究結(jié)果保持一致。

機(jī)體抗感染免疫的第一道防線為天然免疫，Toll樣受體屬于跨膜信號傳遞受體，為天然免疫模式識別受體的重要組成成分，參與病原微生物識別、天然免疫觸發(fā)、獲得性免疫過程[11-12]。TLR2為Toll樣受體家族成員之一，為機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中最為直接的一種模式識別受體，在所有細(xì)胞系中均有表達(dá)，存在于細(xì)胞表面，且其在Toll樣受體家族中為識別配體最多的成員[13-14]，EBV可經(jīng)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將免疫細(xì)胞激活，使其產(chǎn)生過多的炎性因子，參與病理過程。研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，EBV衣殼蛋白經(jīng)TLR2配體所誘導(dǎo)的單核細(xì)胞—巨噬細(xì)胞使TLR2異常高表達(dá)，激活炎性因子，最終作用于抗EBV免疫反應(yīng)過程。在本研究中進(jìn)一步證實(shí)，TLR2在傳染性單核細(xì)胞增多癥中高表達(dá)，且參與此病的發(fā)生發(fā)展。孫丹等[17]在其研究中發(fā)現(xiàn)，傳染性單核細(xì)胞增多癥的患兒外周血單核細(xì)胞TLR2表達(dá)顯著升高，證實(shí)TLR2參與傳染性單核細(xì)胞增多癥的發(fā)生發(fā)展，與本研究結(jié)果保持一致。

Rta是一種EBV復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活子，為一種可調(diào)控病毒由潛伏期進(jìn)入裂解期的啟動子。Rta為BRLF1基因的蛋白產(chǎn)物，其組成包括605個氨基酸，N端的232個氨基酸為DNA的結(jié)合區(qū)域，與二聚體的形成有關(guān)，Rta DNA結(jié)合功能需二聚體形成參與[18-19]。臨床研究顯示[20]，Rta為一種具備序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，可直接與BMLF1啟動子區(qū)域相互作用，促進(jìn)其表達(dá)，也可經(jīng)間接結(jié)合機(jī)制發(fā)揮其激活作用。本結(jié)果證實(shí)Rta與傳染性單核細(xì)胞增多癥發(fā)生相關(guān)， Rta在傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒血漿中高表達(dá)，且與患兒疾病分期、疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，目前臨床上對于Rta參與傳染性單核細(xì)胞增多癥的研究較少，且本研究樣本量較少，上述結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

另外本研究還對sHLA-G、TLR2、Rta三者相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者之間均呈正相關(guān)，均在該病中高表達(dá)，共同參與該病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，sHLA-G、TLR2、Rta在傳染性單核細(xì)胞增多癥中均為異常高表達(dá)，且三者相關(guān)，共同參與此病的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

韓紅滿：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；秦偉：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改;左立輝：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;劉貴敏：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫；李四強(qiáng)：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核