缺血性腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者血清miR-132、miR-135表達(dá)與認(rèn)知功能的關(guān)系及其預(yù)測(cè)價(jià)值

劉欣，吉智，李毓新，劉利寧，惠晶

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是全球常見的致死致殘性疾病，多見于中老年人，隨著我國社會(huì)老齡化進(jìn)程加重，IS發(fā)病率逐漸增加[1]，IS后認(rèn)知功能障礙屬于卒中后異常心理行為，認(rèn)知功能障礙會(huì)延緩神經(jīng)功能恢復(fù)，隨著年齡增長(zhǎng)和疾病進(jìn)展可轉(zhuǎn)變?yōu)榘V呆，嚴(yán)重影響患者工作和生活[2]。目前IS后認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制尚不明確，給疾病早期診斷帶來一定困難，探討IS后認(rèn)知功能障礙相關(guān)分子機(jī)制有助于其預(yù)防、早期診斷和治療。微小核糖核酸(microRNA，miR)在腦組織表達(dá)豐富，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后蛋白表達(dá)，在神經(jīng)發(fā)生、重塑、突觸形成方面發(fā)揮重要作用，可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演至關(guān)重要的角色[3]。miR-132是大腦中主要的微小RNA，參與神經(jīng)元可塑性、樹突生長(zhǎng)調(diào)控和學(xué)習(xí)記憶過程，其表達(dá)異常與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[4]。miR-135是參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的類癌基因，近期研究發(fā)現(xiàn)miR-135參與靶基因與特定神經(jīng)遞質(zhì)/神經(jīng)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)、突觸形成，并可調(diào)節(jié)焦慮相關(guān)的行為[5]?，F(xiàn)分析IS后認(rèn)知功能障礙患者血清miR-132、miR-135表達(dá)與認(rèn)知功能的關(guān)系，以及其預(yù)測(cè)認(rèn)知功能障礙的價(jià)值，以期為臨床診治提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月—2020年3月西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治IS患者147例，根據(jù)是否發(fā)生認(rèn)知功能障礙將其分為障礙組(60例)和非障礙組(87例)。障礙組男35例，女25例，年齡61～75(68.25±3.26)歲；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?5例，糖尿病40例，高脂血癥29例；受教育年限9～13(9.25±2.26)年；病程2～7(5.01±1.35)個(gè)月；臨床分期：恢復(fù)期41例，后遺癥期19例；合并癥：冠心病29例，心律失常12例，肺炎16例；既往治療史：靜脈溶栓21例，介入治療17例，單純藥物治療22例；有腦卒中遺傳史13例。非障礙組男51例，女36例，年齡60～74(65.04±3.19)歲；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?2例，糖尿病41例，高脂血癥30例；受教育年限9～15(11.31±3.52)年；病程3～8(5.12±1.35)個(gè)月；臨床分期：恢復(fù)期52例，后遺癥期35例；合并癥：冠心病31例，心律失常19例，肺炎23例；既往治療史：靜脈溶栓29例，介入治療23例，單純藥物治療35例；有腦卒中遺傳史19例。2組性別、既往治療史、臨床分期及合并癥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。障礙組年齡、合并高血壓比例、合并糖尿病比例高于非障礙組(P<0.05)，受教育年限低于非障礙組(P<0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)頭顱MR或CT診斷IS，符合“中國急性缺血性腦卒中診治指南2014”診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②IS前無認(rèn)知功能障礙；③初中以上文化程度。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①顱腦外傷、顱內(nèi)占位性病變、腦出血、腦血管畸形等患者；②生命體征不平穩(wěn)者，合并惡性腫瘤，難以控制的慢性內(nèi)科疾病嚴(yán)重并發(fā)癥；③卒中后抑郁、失語、嚴(yán)重精神疾病等影響各種量表評(píng)定者；④其他原因引起的認(rèn)知功能障礙。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-132、miR-135檢測(cè)：2組均于入院次日晨采集空腹肘靜脈血6 ml，注入不含抗凝劑的無菌試管，4 ℃、離心取血清分裝于2支EP 管置于-80 ℃ 超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)保存。取1支樣本加入TRIzol(美國Invitrogen公司)提取總RNA，ND-1000 紫外分光光度計(jì)(NanoDrop公司)檢測(cè)RNA純度和完整性。取總RNA 20 μg，采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系20 μl;反應(yīng)條件：15℃ 30 min、45℃ 30 min、85℃ 5 min 滅活。CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR 儀(美國Bio-Rad)檢測(cè)血清miR-132、miR-135表達(dá)；qRT-PCR流程：將cDNA樣品分別加入qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)液配制如下，PCR 0.4 μl引物F (10 μmol/L)、0.4 μl PCR 引物R (10 μmol/L)、PCR緩沖液1 μl(10×)、dNTP 1 μl(2.5 mmol/L)、氯化鎂溶液0.6 μl、Taq聚合酶0.5 U、 ROX Reference Dye 0.2 μl、熒光染料Syber greenI 2.5 μmol/L，加水至8 μl。反應(yīng)條件：95℃變性15 s， 65℃退火20 s; 75℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。引物購自金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，序列如下。miR-132上游:5'-GCCGATAACAGTCTACAGC-3',下游：5'-CAGTGCAGGG TCCGAGG-3'；miR-135上游:5'-ACAUAGGAAUAAAAA GCCAUATT-3',下游：5'-CUAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA-3'；U6上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游：5'CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，共做3次平行試驗(yàn)。以U6 snRNA 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算miR-132、miR-135相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 血清NSE、S-100β蛋白檢測(cè)： 取另一支樣本采用意大利BIOBASE2000型全自動(dòng)酶免分析儀，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、S-100鈣結(jié)合蛋白β(S-100β)水平，試劑盒購自上海貝西生物制劑公司，操作嚴(yán)格按其說明書進(jìn)行。

1.3.3 認(rèn)知功能評(píng)估： (1)應(yīng)用中文版MoCA[7]評(píng)估患者認(rèn)知功能，該量表共8個(gè)領(lǐng)域(視空間執(zhí)行、命名、定向、記憶、注意力、抽象、延遲回憶、語言)，11個(gè)條目(視空間執(zhí)行：交替連線、復(fù)制立方體、畫鐘；語言：復(fù)述、語言流暢性，其余各領(lǐng)域各1個(gè)條目)，滿分30分，評(píng)分越低認(rèn)知功能越低，<26分為異常。(2)應(yīng)用簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)[8]從定向、回憶、計(jì)算、語言、復(fù)述、執(zhí)行功能與命名等7項(xiàng)評(píng)估，回答正確1分，錯(cuò)誤或不知道0分，滿分30分，評(píng)分越低認(rèn)知功能越低，<26分為異常。根據(jù)MMSE評(píng)分將認(rèn)知功能障礙患者60例分為輕度亞組19例(MMSE評(píng)分20～25分)、中度亞組27例(MMSE評(píng)分11～19分)、重度亞組14例(MMSE評(píng)分≤10分)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分比較 障礙組患者血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分均低于非障礙組(P<0.01)，見表1。

表1 2組患者血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分比較

2.2 認(rèn)知功能障礙患者各亞組血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分比較 血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分比較，輕度亞組>中度亞組>重度亞組(P均<0.01)，見表2。

表2 障礙組各亞組患者血清miR-132、miR-135、NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分比較

2.3 血清miR-132、miR-135表達(dá)與血清NSE、S-100β水平、MoCA評(píng)分的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析顯示，IS后認(rèn)知障礙患者血清miR-132、miR-135表達(dá)均與血清NSE、S-100β水平、MoCA評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.680、0.644、0.751，0.517、0.503、0.698，P均=0.000)。

2.4 血清miR-132、miR-135、miR-132+miR-135預(yù)測(cè)IS后認(rèn)知功能障礙的價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-132、miR-135、miR-132+miR-135預(yù)測(cè)IS后認(rèn)知功能障礙的曲線下面積(AUC)分別為0.667、0.657、0.902，miR-135、miR-132最佳截?cái)嘀?cut-off)分別為0.72、0.69， miR-132+miR-135預(yù)測(cè)IS后認(rèn)知功能障礙的AUC最大 (Z=2.956、3.052，P均<0.05)， 見表3、圖1。

表3 血清miR-132、miR-135、聯(lián)合miR-132+miR-135預(yù)測(cè)IS后認(rèn)知功能障礙的效能

3 討 論

腦卒中是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的主要原因，反復(fù)發(fā)作的腦卒中可增加認(rèn)知功能障礙患病率和認(rèn)知功能受損程度[10-11]，另外年齡、教育程度、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙與IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生也有密切關(guān)系。目前IS后認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制尚不清楚，炎性反應(yīng)、免疫、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮毒性、Ca2+超載等均涉及IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)病過程，而腦卒中引起海馬、白質(zhì)等關(guān)鍵部位病變是認(rèn)知功能障礙發(fā)病的解剖學(xué)機(jī)制[12-13]。miRNAs在腦組織尤其是海馬組織中表達(dá)較豐富，參與神經(jīng)系統(tǒng)各類信號(hào)通路基因調(diào)控，具有調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化、增殖、凋亡作用，參與學(xué)習(xí)、記憶等過程[3]。miR-132定位于染色體17p13.3，在腦組織尤其是海馬區(qū)高表達(dá)，具有調(diào)控多種蛋白表達(dá)，突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和功能作用，參與突觸可塑性、學(xué)習(xí)、記憶等多種神經(jīng)生理過程[14]。miR-132表達(dá)異常與阿爾茨海默病、精神分裂癥、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[15-16]。認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)異常均有關(guān)，推測(cè)miR-132可能參與IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生過程。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-132表達(dá)與IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生和進(jìn)展均有關(guān)，動(dòng)物研究顯示[17]，癡呆小鼠模型中miR-132表達(dá)下調(diào)。miR-132參與IS后認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制為：(1)miR-132表達(dá)缺失可促使肌醇1,4,5-三磷酸三激酶B(ITPKB)上調(diào)，激活ERK1/2信號(hào)通路，增加重組人β分泌酶活性，促使β淀粉樣蛋白(Aβ)產(chǎn)生沉積及Tau蛋白磷酸化，從而加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能受損，提示miR-132/ ITPKB通路可能參與認(rèn)知功能障礙發(fā)生的病理過程[17]。(2)miR-132表達(dá)缺失可能上調(diào)神經(jīng)退化相關(guān)蛋白質(zhì),如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5、線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1等，并通過直接調(diào)控神經(jīng)元一氧化氮合酶，促使一氧化氮產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)Tau蛋白磷酸化參與認(rèn)知功能障礙發(fā)病過程[18]。(3)miR-132可調(diào)控神經(jīng)環(huán)路—突觸可塑性，改善IS后癡呆大鼠行為學(xué)特征[2]，以上結(jié)果說明miR-132缺乏可能導(dǎo)致IS后認(rèn)知功能的下降。

miR-135是非編碼微小單鏈RNA，在人體內(nèi)結(jié)合于靶基因miRNA 3' 端非翻譯區(qū)，通過抑制Wnt信號(hào)通路APC基因表達(dá)促使細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，參與胰腺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤發(fā)病[19-22]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-135可抑制突觸核蛋白水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，miR-135是大腦對(duì)運(yùn)動(dòng)反應(yīng)的第一個(gè)非編碼RNA調(diào)控因子，對(duì)防止腦組織病理性老化有促進(jìn)作用[23]。miR-135是軸突生長(zhǎng)和皮質(zhì)神經(jīng)元遷移的有效刺激因子，miR-135受軸突生長(zhǎng)和再生的內(nèi)在抑制因子Kruppel樣因子4(KLF4)調(diào)節(jié)，沉默KLF4可發(fā)揮miR-135神經(jīng)保護(hù)作用，miR-135通過miR-135—KLF4通路參與神經(jīng)調(diào)節(jié)過程。miR-135通過抑制KLF4促進(jìn)成年小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生[24]。本結(jié)果提示，miR-135與IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生和進(jìn)展均有關(guān)。但是miR-135在IS后認(rèn)知功能障礙中的作用機(jī)制尚不清楚，目前相關(guān)報(bào)道并不多見，推測(cè)可能為：miR-135通過調(diào)控下游因子肌醇1，4，5-三磷酸腺苷受體1、肌醇聚磷酸酯-4-磷酸酯酶Ⅰ型的表達(dá)，增加小鼠齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，使神經(jīng)發(fā)生增加[23]，因此miR-135表達(dá)缺失可能導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡，神經(jīng)元功能破壞，進(jìn)而引起認(rèn)知功能障礙。 NSE、S-100β是腦損傷相關(guān)細(xì)胞因子，在神經(jīng)元損傷后即從星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)釋放進(jìn)入腦脊液并經(jīng)血腦屏障入血，能敏感反映腦損傷情況。MoCA是評(píng)估認(rèn)知功能的常用量表，其評(píng)分隨認(rèn)知功能受損程度加重而降低。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-132、miR-135表達(dá)均與血清NSE、S-100β水平及MoCA評(píng)分呈正相關(guān)，表明IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生可能與神經(jīng)受損有關(guān)，由于目前缺乏miR-132、miR-135與NSE、S-100β作用機(jī)制研究，其間關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不清楚。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-132、miR-135對(duì)IS后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，聯(lián)合miR-132、miR-135可大大提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，提示miR-132、miR-135表達(dá)均降低時(shí)，IS患者認(rèn)知功能受損程度更重，發(fā)生認(rèn)知功能障礙的可能性越大，對(duì)臨床診斷具有警示作用。

綜上所述，血清miR-132、miR-135表達(dá)降低與IS后認(rèn)知功能障礙發(fā)生、神經(jīng)損傷程度均存在一定關(guān)系，可以為臨床IS后認(rèn)知功能受損程度評(píng)估提供一定參考。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉欣：提出研究方向、設(shè)計(jì)研究方案、起草論文；吉智：修訂論文，論文終審；李毓新：實(shí)施研究過程、數(shù)據(jù)收集、分析整理；劉利寧、惠晶：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理