蜂蜜中嗜滲酵母濾膜過(guò)濾法和涂布法對(duì)比分析

朱 平，淦永鑒，肖 蕓，劉芯韻

（四川國(guó)檢檢測(cè)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000）

近來(lái)媒體少有關(guān)于蜂蜜中嗜滲酵母含量超標(biāo)的報(bào)道，主要有兩個(gè)原因，首先是蜂蜜企業(yè)對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)，其次是蜂蜜企業(yè)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)的重視。既把好了生產(chǎn)關(guān)，同時(shí)又抓緊了出廠關(guān)。蜂蜜在出廠時(shí)對(duì)嗜滲酵母檢測(cè)，使用商品化培養(yǎng)，避免檢驗(yàn)員在檢測(cè)嗜滲酵母時(shí)配置培養(yǎng)基的質(zhì)量不好，影響檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，同時(shí)還能提高檢測(cè)工作效率[1]。李閩真等[2]在春季采集的30 份巢蜜樣品中嗜滲酵母檢出率達(dá)100.0%，而在夏季采集的20 份巢蜜樣品檢出率為55.0%，說(shuō)明蜂蜜的原材料中普遍都含有嗜滲酵母。

嗜滲酵母屬于微生物，因此具備微生物所有的基本特性。雖然體積小，但是表面積大，在適宜的條件下生長(zhǎng)繁殖速度快，新陳代謝也快。嗜滲酵母的大量存在會(huì)對(duì)蜂蜜品質(zhì)和風(fēng)味造成不利影響[3]。蜂蜜被嗜滲酵母污染后會(huì)影響其產(chǎn)品質(zhì)量，一旦抽檢檢測(cè)出嗜滲酵母不合格，企業(yè)將會(huì)面臨相應(yīng)處罰，這樣對(duì)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)就是負(fù)擔(dān)，還會(huì)制約企業(yè)的發(fā)展，并使企業(yè)在消費(fèi)者面前的形象受損。

1 實(shí)驗(yàn)方法

涂布法的操作過(guò)程參照GB14963-2011 附錄A 中嗜滲酵母計(jì)數(shù)檢測(cè)方法，在無(wú)菌環(huán)境下稱(chēng)量蜂蜜樣品25 g 加入到225 g 30%葡萄糖溶液中，充分振蕩或均質(zhì)，制備成為1∶10 的均勻稀釋液。用無(wú)菌吸管吸取稀釋液1 mL，注入含有9 mL 30%葡萄糖稀釋液的試管內(nèi)，置于漩渦混懸儀上混勻，制備1:100 的稀釋液。在充分混合稀釋液之后，立即在每個(gè)平板表面接種0.1 mL。每個(gè)稀釋度接種2 個(gè)氯硝胺18%甘油（DG18） 瓊脂平皿[4]。

濾膜過(guò)濾法的操作過(guò)程參照 SN/T 4675.28-2016 出口葡萄酒中細(xì)菌、霉菌及酵母的計(jì)數(shù)方法。選用濾膜微孔徑為0.45μm，用無(wú)菌鑷子夾取無(wú)菌濾膜邊緣，將正面朝上，貼放在已經(jīng)滅菌的濾床上，固定好濾器。加入濾液，打開(kāi)濾器閥門(mén)，在-0.5 個(gè)大氣壓下抽濾。抽濾完后，再抽濾5s，關(guān)掉濾器閥門(mén)和真空泵，取下濾膜，貼到培養(yǎng)基上，截留菌面向上，且膜與培養(yǎng)基之間不得有氣泡[5]。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，過(guò)濾時(shí)，先注入約50 mL無(wú)菌生理鹽水到濾杯中，然后分別加入0.1 mL，1 mL，10 mL 的蜂蜜均勻稀釋液（1∶10），每個(gè)接種體積重復(fù)過(guò)濾一組平行平板。

2 結(jié)果

采用這以上種方法同時(shí)對(duì)同一蜂蜜樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后放置于同一培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃±1℃避光培養(yǎng)7 d。分為6 批次對(duì)蜂蜜樣本開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。嗜滲酵母在平板上生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 嗜滲酵母計(jì)數(shù)（CFU/平板）

每天都要對(duì)嗜滲酵母生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，并記錄數(shù)目。膜上嗜滲酵母數(shù)目比較多且密集的時(shí)候，一定要盡量數(shù)清楚。如果7 天及以?xún)?nèi)，膜上嗜滲酵母已被霉菌覆蓋，本實(shí)驗(yàn)以采用最近一次出的結(jié)果記錄。當(dāng)數(shù)量大于100 的時(shí)候，本實(shí)驗(yàn)記錄結(jié)果為多不可計(jì)。嗜滲酵母計(jì)數(shù)最終結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 嗜滲酵母計(jì)數(shù)（CFU/g）

蜂蜜以1:10 的均勻稀釋液0.1 mL 接種涂布平皿時(shí)，實(shí)際蜂蜜的接種量約有0.01g，相當(dāng)于100 倍稀釋倍數(shù)。當(dāng)以1∶100 的均勻稀釋液0.1 mL 接種涂布平皿時(shí)，實(shí)際蜂蜜的接種量約有0.001 g，相當(dāng)于1000 倍稀釋倍數(shù)。100 倍稀釋倍數(shù)就是最低稀釋倍數(shù)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。遇到這種情況，蜂蜜中嗜滲酵母的數(shù)量將會(huì)報(bào)告為小于100（CFU/g）。

由表2 可以看出，樣品3 在兩種方法下均無(wú)嗜滲酵母生長(zhǎng)。樣品2、樣品5 以及樣品6中嗜滲酵母含量≥100 CFU/g，涂布法和濾膜過(guò)濾法得到的結(jié)果都比較接近，重復(fù)性極限r(nóng)=0.25，并無(wú)顯著差異。當(dāng)蜂蜜中嗜滲酵母含量大于1 且小于100 CFU/g 低含量時(shí)，這種涂布方法就會(huì)不容易檢測(cè)出來(lái)，得到的結(jié)果為＜100 CFU/g。由此低含量的嗜滲酵母存在，勢(shì)必會(huì)對(duì)蜂蜜后期儲(chǔ)存過(guò)程中帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。

由本實(shí)驗(yàn)可知，過(guò)濾法能檢測(cè)出＞1CFU/g的嗜滲酵母，樣品1 和4 就是很好的例子。有利于企業(yè)在原材料和半成品以及成品監(jiān)測(cè)中及時(shí)發(fā)現(xiàn)低含量嗜滲酵母，反饋到生產(chǎn)工藝中，找出產(chǎn)生問(wèn)題原因，加強(qiáng)生產(chǎn)環(huán)節(jié)控制。