張彥,汪天賜,蔡婧,李亞娟
作者單位:1空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科,陜西 西安710032;2空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系,陜西 西安710032
2型糖尿病是最常見的慢性老年性疾病之一,占糖尿病病人總?cè)丝诘木懦梢陨稀kS著全世界老齡化問題的日益嚴(yán)峻,2 型糖尿病病人數(shù)量也在逐年上升[1-2]。2型糖尿病會(huì)累積機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生慢性并發(fā)癥,而其自身的創(chuàng)傷修復(fù)困難問題也是長期困擾醫(yī)務(wù)人員的一個(gè)重要難題,嚴(yán)重威脅著病人的生理和心理健康[3]。機(jī)體系統(tǒng)代謝紊亂、自身免疫力下降、創(chuàng)傷部位細(xì)菌繁殖、加劇的炎癥反應(yīng)等都是誘發(fā)2型糖尿病創(chuàng)傷愈合困難的關(guān)鍵因素[4-5]。目前臨床上應(yīng)對(duì)2型糖尿病創(chuàng)傷愈合問題仍以控制血糖為主要手段,但是仍缺乏有效且安全的治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是綠茶茶多酚中的核心化學(xué)成分,其抗菌、抗氧化、抗腫瘤等功效已得到大量的動(dòng)物和臨床研究證實(shí)[6-9]。近年來的研究也發(fā)現(xiàn),EGCG 能夠憑借其顯著的抗炎癥反應(yīng)功效,在促進(jìn)正常和1型糖尿病軟組織創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮重要作用[10-12]。但是,EGCG能否顯著改善發(fā)病人群更廣泛的糖尿病類型——2型糖尿病的創(chuàng)傷修復(fù)困難問題,迄今仍未有研究記載。本實(shí)驗(yàn)于2015年1月至2016年1月通過應(yīng)用瘦素受體缺陷的2型糖尿病db/db小鼠作為動(dòng)物模型,系統(tǒng)評(píng)價(jià)EGCG對(duì)于2型糖尿病傷口愈合的治療效果。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備2 型糖尿病db/db 小鼠 32 只[BKS.Cg-m+/+Leprdb/J,3 月齡,雄性,無特定病原體(SPF)級(jí),體質(zhì)量(41.50±7.95)g],以及與它們相同背景的雄性野生型小鼠16只,體質(zhì)量(19.72±2.85)g,全部購于南京生物醫(yī)藥研究院(協(xié)議許可編號(hào):NBRI[2014]314),醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)20120001;EGCG,購于美國Sigma 公司;麻醉藥戊巴比妥鈉緩沖液,購于美國Sigma-Aldrich 公司;血糖測試儀,購于美國Johnson&Johnson公司;3M Tegaderm透明薄膜敷貼,購于美國3M Healthcare 公司;伺服式生物力學(xué)萬能材料測試機(jī),購于東莞市昆侖檢測儀器公司;用于拍攝傷口圖像的照相機(jī),購于日本Canon公司;小鼠軟組織酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒,購于武漢華美生物公司;激光多普勒血流測量系統(tǒng)以及與其配套的皮膚接觸探頭,購于英國Moor Instruments公司。
1.2背部軟組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建及EGCG治療本研究獲空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(許可編號(hào):20140209),所有涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作步驟與實(shí)驗(yàn)流程均按照協(xié)議規(guī)定嚴(yán)格執(zhí)行。所有小鼠抵達(dá)本實(shí)驗(yàn)室后,適應(yīng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。1周后,于上午(8~10時(shí))對(duì)全部小鼠進(jìn)行尾部提取靜脈血,使用血糖測試儀測量隨機(jī)血糖水平,血糖水平>16.7 mmol/L的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)定模型達(dá)到標(biāo)準(zhǔn),即被納入實(shí)驗(yàn)。本研究被劃分為野生型小鼠組(Control)、db/db 小鼠組(db/db)及 db/db 施以 EGCG 治療組(db/db+EGCG)共三組,每組動(dòng)物樣本量n=16。在全部48 只小鼠的背部手術(shù)創(chuàng)建一處皮膚損傷模型,主要操作流程包括:以戊巴比妥鈉腹腔注射的形式對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行麻醉,通過應(yīng)用皮膚活檢針在所有小鼠的背部構(gòu)建1 個(gè)直徑為1 cm 的圓形傷口,確保與皮膚、真皮和肌膜充分剝離,并覆蓋以3M薄膜敷貼。隨后皮下注射青/鏈霉素預(yù)防潛在的創(chuàng)傷感染。分別在術(shù)后第5、12、19天對(duì)每組4只動(dòng)物施以過量戊巴比妥鈉安樂死,對(duì)于每組余下4 只動(dòng)物用于定量評(píng)價(jià)傷口完全愈合所花費(fèi)的時(shí)長。db/db+EGCG組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在組織損傷模型建立后立即予以每日的EGCG(10 mg/kg)灌胃處理。
1.3小鼠傷口組織局部血流速率的測試分析于軟組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建的第5、12、19 天,通過應(yīng)用激光多普勒血流測量系統(tǒng)對(duì)小鼠背部傷口位置的局部血流速率進(jìn)行定量測試分析。主要測量步驟為:將激光多普勒測量儀的探頭放置于小鼠傷口的正中央位置,探頭由激光發(fā)射器經(jīng)發(fā)生纖維將激光束(780 nm波長)照射至傷口位置,通過探頭內(nèi)的接收纖維陣列將光信號(hào)以40 Hz的采樣速率采集傳遞至多普勒的信號(hào)處理系統(tǒng)中,最后經(jīng)自動(dòng)的數(shù)據(jù)處理獲得小鼠傷口位置的最終局部血流速數(shù)值。
1.4小鼠軟組織傷口愈合率的測試評(píng)估于軟組織創(chuàng)傷建立的術(shù)后0、5、12、19天進(jìn)行背部軟組織創(chuàng)傷的圖像采集。主要步驟包括:將戊巴比妥鈉麻醉的動(dòng)物固定在解剖手術(shù)臺(tái)上,確保動(dòng)物無任何微移動(dòng),數(shù)碼相機(jī)通過三腳架精確固定在小鼠背部傷口位置正上20 cm,待視野充分穩(wěn)定后進(jìn)行圖像采集。使用自行編寫的Matlab 軟件程序?qū)D像中的創(chuàng)傷區(qū)域進(jìn)行圖像處理與分析(包括顏色閾值分割算法、局部自適應(yīng)邊緣提取算法等)。待軟件分析完畢后,獲得創(chuàng)傷位置的面積數(shù)值,通過公式計(jì)算傷口愈合率,作為評(píng)價(jià)軟組織愈合進(jìn)度的標(biāo)尺:傷口愈合率=(第0 天傷口面積-第n天傷口面積)/第0天傷口面積×100%。
1.5小鼠創(chuàng)傷組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的測試評(píng)估待傷口愈合率測試完畢后,對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的小鼠背部軟組織進(jìn)行取材分離,使用手術(shù)剪將皮膚軟組織生物標(biāo)本修剪為8 mm2×8 mm2的正方形狀,隨后迅速浸泡于0.9%氯化鈉溶液平衡緩沖液中以避免組織干燥。使用伺服式生物力學(xué)萬能材料測試機(jī)對(duì)軟組織進(jìn)行力學(xué)拉伸測試,主要步驟為:力學(xué)測試機(jī)的兩個(gè)預(yù)制夾具將軟組織標(biāo)本夾緊,確保傷口與夾具水平對(duì)稱,施加1 N的力預(yù)加載將樣本拉緊,待穩(wěn)定后以20 mm/min的位移速度反向移動(dòng)兩個(gè)夾具,從而在組織標(biāo)本產(chǎn)生軸向拉神應(yīng)力載荷,系統(tǒng)自動(dòng)記錄應(yīng)力與位移的時(shí)間變化關(guān)系,獲取組織標(biāo)本發(fā)生完全破裂時(shí)的斷裂載荷作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。
1.6小鼠傷口組織的ELISA測試評(píng)估力學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后,取各組小鼠創(chuàng)傷位置余下的組織樣本用作ELISA測試。使用武漢華美生物公司的小鼠ELISA檢測試劑盒對(duì)軟組織中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)進(jìn)行測試(貨號(hào)分別為CSB-E08054m、CSB-E04639m、CSB-E04741m 和CSB-E04756m)。所有實(shí)驗(yàn)操作步驟均按照試劑盒的說明執(zhí)行。ELISA 檢測基于雙抗體夾心法原理,整個(gè)過程包括酶標(biāo)板包被、血清樣本上樣、加入酶標(biāo)抗體、加入底物液顯色、終止反應(yīng)以及酶標(biāo)儀吸光度檢測,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,取測量平均值。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以xˉ±s表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測應(yīng)用SPSS 22.0 軟件。使用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni 校正法分析來進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的每兩組之間的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠血糖和體質(zhì)量的影響如圖1A所示,三組小鼠體質(zhì)量比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19天的F值分別為78.677、55.069 和 23.499,P值均小于 0.001。db/db小鼠在軟組織傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的體質(zhì)量值分別為(42.5±4.7)g、(44.6±5.5)g 及(45.1±6.1)g,而Control組小鼠體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)分別為(20.3±2.5)g、(21.2±1.9)g及(22.6±2.3)g,db/db組顯著高于Control 組小鼠(P<0.01),而db/db+EGCG 組小鼠的體質(zhì)量值在第 5、12、19 天分別為(43.6±7.1)g、(45.5±6.9)g及(47.1±7.2)g,均顯著高于Control組(P<0.01),但是與db/db 小鼠的體質(zhì)量值在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
如圖1B所示,三組小鼠血糖比較的單因素方差分析在術(shù)后的第 5、12、19 天的F值分別為 80.251、59.812和29.918,P值均小于0.001。db/db小鼠在軟組織傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的隨機(jī)血糖值分別為(21.5±2.6)mmol/L、(19.8±2.1)mmol/L 及(20.6±2.7)mmol/L,而Control 組小鼠體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)分別為(6.1±0.9)mmol/L、(5.4±0.7)mmol/L及(5.7±0.9)mmol/L,db/db組顯著高于Control組小鼠(P<0.01)。db/db+EGCG 組小鼠的體質(zhì)量值在第 5、12、19 天分別為(23.1±3.5)mmol/L、(22.4±3.9)mmol/L 及(22.5±3.8)mmol/L,均顯著高于Control組(P<0.01)。但是db/db 組與db/db+EGCG 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠組內(nèi)在術(shù)后第 5、12、19 天的體質(zhì)量和血糖均未發(fā)生顯著性變化(P>0.05),表明各組小鼠的體質(zhì)量和血糖因素在術(shù)后19 天內(nèi)并未發(fā)生明顯改變。
圖1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠體質(zhì)量(A)和血糖(B)的影響
圖2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)治療對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口愈合速率(A)和總愈合時(shí)間(B)的影響
2.2 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口愈合率和總愈合時(shí)間的影響三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19 天的傷口愈合率的比較結(jié)果如圖2A所示。三組間傷口愈合率比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19天的F值分別為20.953、20.788和22.543,P值均小于0.001。db/db小鼠在術(shù)后的第5、12、19 天的傷口愈合率分別為(10.1±2.0)%、(39.1±5.2)%及(59.2±6.2)%,均顯著低于Control 組在各時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合率,分別為(22.1±3.0)%、(60.3±4.5)%及(85.4±5.9)%,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)P值均小于0.001;而db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后的第5、12、19天的傷口愈合率均顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的db/db 小鼠[(19.4±3.2)%比(10.1±2.0)%,P=0.003;(55.2±4.8)%比(39.1±5.2)%,P=0.003;(79.7±5.2)%比(59.2±6.2)%,P=0.002]。本研究也發(fā)現(xiàn),db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合率與Control 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.583、0.523 和0.603)。三組小鼠總愈合時(shí)間的對(duì)比結(jié)果如圖2B 所示。三組間傷口愈合時(shí)間比較的單因素方差分析的F值為14.153、P值為0.002。與Control組小鼠相比,db/db組小鼠的傷口總愈合時(shí)間顯著延長,(39.9±5.4)d 比(22.9±4.3)d,P=0.003;而db/db+EGCG 組小鼠的傷口愈合時(shí)間顯著低于db/db 組小鼠,(25.1±4.9)d 比(39.9±5.4)d,P=0.006。本研究也發(fā)現(xiàn),db/db+EGCG 組小鼠的傷口愈合時(shí)間與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.999)。
2.3 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的影響Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19 天的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的比較結(jié)果如圖3 所示。三組間傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19天的F值分別為25.885、16.801 和 20.322,P值均小于 0.001。db/db小鼠的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著低于空白對(duì)照的Control 組,分別為(4.5±0.9)kg/mm2比(9.5±1.1)kg/mm2;(7.8±1.0)kg/mm2比(12.2 ± 2.0)kg/mm2;(10.2 ± 1.5)kg/mm2比(18.3±2.1)kg/mm2,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)P值均小于0.001;但是,db/db+EGCG組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度均顯著高于db/db 組小鼠,分別為(8.0±1.0)kg/mm2比(4.5±0.9)kg/mm2,P=0.003;(12.2±1.7)kg/mm2比(7.8±1.0)kg/mm2,P=0.009;(16.2±2.0)kg/mm2比(10.2±1.5)kg/mm2,P=0.004。本研究也發(fā)現(xiàn),db/db+EGCG組小鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度與Control 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.179、0.300和0.458)。
圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的影響
圖4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)治療對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織位置局部血流速度的影響
2.4 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織位置局部血流速率的影響Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第 5、12、19 天的傷口組織位置局部血流速率的比較結(jié)果如圖4 所示。三組間傷口組織局部血流速率比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為19.786、69.561 和 38.748,P值均小于 0.001。db/db小鼠在術(shù)后第5、12、19天的傷口組織位置局部血流速率分別為(0.51±0.08)、(0.39±0.12)和(0.49±0.13),而Control組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口組織位置局部血流速率分別為(1.00±0.12)、(1.35±0.11)和(1.24±0.13),db/db組均顯著低于Control組,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)P值均小于0.001;而db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后的第5、12、19天的傷口組織位置局部血流速率均顯著高于db/db組小鼠[(0.78±0.12)比(0.51±0.08),P=0.020;(1.08±0.13)比(0.39±0.12),P=0.001;(1.01±0.11)比(0.49±0.13),P=0.001]。本研究也發(fā)現(xiàn),db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口組織位置局部血流速率也顯著低于Control 組(P值分別為0.047、0.036和0.048)。
2.5 EGCG對(duì)于db/db小鼠傷口組織中重要細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)的比較結(jié)果如圖5 所示。三組間IL-1β 比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為21.145、59.281 和 23.162,P值均小于 0.001。db/db小鼠在術(shù)后第5、12、19 天的傷口組織IL-1β 表達(dá)量分別為(205.4±15.4)pg/mL、(271.4±26.3)pg/mL 和(187.5±18.2)pg/mL,而db/db+EGCG 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn) IL-1β 表達(dá)量分別為(162.1±15.5)pg/mL、(200.8±20.2)pg/mL和(139.2±17.8)pg/mL,均顯著低于db/db組(P<0.01)。三組間IL-6比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為23.295、66.094 和 26.108,P值均小于 0.001。db/db小鼠在術(shù)后第5、12、19 天的傷口組織IL-6 表達(dá)量分別為(244.4±18.3)pg/mL、(322.9±31.3)pg/mL 和(233.2±21.7)pg/mL,而db/db+EGCG 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn) IL-6 表達(dá)量分別為(181.2±18.2)pg/mL、(235.3±19.2)pg/mL 和(159.2±17.5)pg/mL,均顯著低于db/db 組(P<0.01)。三組間TNF-α 比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為 18.055、30.762 和 35.471,P值均小于 0.001。db/db 小鼠在術(shù)后第 5、12、19 天的傷口組織 TNF-α 表達(dá)量分別為(962.7±92.9)pg/mL、(1169.2±104.6)pg/mL 和(870.8±87.1)pg/mL,而db/db+EGCG 組TNF-α表達(dá)量分別為(771.2±79.2)pg/mL、(998.4±107.4)pg/mL 和(621.5±81.2)pg/mL,均顯著低于 db/db 組(P<0.01)。三組間VEGF 比較的單因素方差分析在術(shù)后的第 5、12、19 天的F值分別為 22.098、50.117 和 30.005,P值均小于 0.001。db/db 小鼠在術(shù)后第 5、12、19 天的傷口組織 VEGF 表達(dá)量分別為(395.1± 36.7)pg/mL、(430.2± 28.2)pg/mL 和(377.5±26.8)pg/mL,而 db/db+EGCG 組 VEGF 表達(dá)量分別為(442.1±29.2)pg/mL、(490.2±24.3)pg/mL和(430.2±22.6)pg/mL,均顯著高于db/db 組(P<0.01)。
EGCG 作為從綠茶中提取的一種成分,是綠茶中最主要的活性和水溶性成分。大量研究證實(shí),EGCG 具有非常強(qiáng)的抗氧化和抗炎抑菌功效,并被發(fā)現(xiàn)在抗腫瘤及治療心血管疾病中發(fā)揮了積極作用[6-8]。雖然近年來的研究也發(fā)現(xiàn)EGCG 能夠加速正常和1 型糖尿病軟組織的創(chuàng)傷愈合[9-12],但是EGCG 是否能夠?qū)τ诟鼮榧智野l(fā)生率更高的2 型糖尿病的傷口愈合修復(fù)產(chǎn)生積極效果尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中使用了db/db 小鼠動(dòng)物模型作為2型糖尿病研究的實(shí)驗(yàn)工具。db/db 小鼠是瘦素受體特異性缺陷的基因修飾小鼠,瘦素作為脂肪組織分泌的激素分子,能夠作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞,發(fā)揮抑制食欲,減少能量攝取,抑制脂肪合成的作用。而瘦素受體缺陷的db/db 小鼠則表現(xiàn)出肥胖、高血糖、多飲、多尿、多食等與臨床2 型糖尿病相似的體征,而該模型小鼠也是目前實(shí)驗(yàn)室中對(duì)于2型糖尿病及其并發(fā)癥研究的最常用的動(dòng)物模型之一[13-15]。
圖5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)治療對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)的影響:A為白細(xì)胞介素1β(IL-1β);B為白細(xì)胞介素6(IL-6);C為腫瘤壞死因子α(TNF-α);D為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)
本研究發(fā)現(xiàn),db/db小鼠在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合速率均顯著低于空白對(duì)照組小鼠,同時(shí)db/db小鼠的創(chuàng)傷總愈合時(shí)間顯著高于空白對(duì)照小鼠,提示2 型糖尿病的db/db 小鼠的傷口愈合進(jìn)程顯著延遲,這與臨床上2型糖尿病的傷口愈合特征類似[16]。本研究使用EGCG(10 mg/kg)對(duì)db/db小鼠的創(chuàng)傷進(jìn)行治療,該劑量已被諸多先前研究證實(shí)能夠顯著加速傷口的愈合和修復(fù)[11,17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGCG(10 mg/kg)在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著提升db/db 小鼠的傷口愈合速率,并能夠顯著縮短db/db 小鼠傷口愈合的總時(shí)長。本研究結(jié)果提示,EGCG 具有改善2型糖尿病db/db小鼠軟組織創(chuàng)傷愈合障礙,加速傷口愈合修復(fù)的作用功效。
本研究生物力學(xué)測試結(jié)果表明,db/db小鼠的傷口外周組織的抗張強(qiáng)度顯著低于空白對(duì)照的Control 組小鼠,提示2 型糖尿病的db/db 小鼠傷口組織硬度和韌性顯著降低。而軟組織的抗張強(qiáng)度大小主要由膠原纖維的數(shù)量和排列所決定的[18],因此本研究結(jié)果表明db/db小鼠傷口愈合速率降低與傷口位置膠原纖維的破壞部分相關(guān)。而本研究進(jìn)一步揭示,EGCG(10 mg/kg)在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著提升了db/db 小鼠傷口組織的生物力學(xué)抗張強(qiáng)度,提示EGCG能夠顯著抑制2型糖尿病傷口及其外周組織的膠原蛋白破壞進(jìn)程。
創(chuàng)傷發(fā)生后,其局部微環(huán)境的血流供應(yīng)在整個(gè)傷口的修復(fù)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。而大量研究也提示,2 型糖尿病的傷口修復(fù)功能障礙也與其高糖環(huán)境所誘發(fā)的局部微循環(huán)障礙具有密切關(guān)聯(lián)[19]。本研究通過激光多普勒血流測量發(fā)現(xiàn),db/db小鼠傷口位置的局部血流速率在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于空白對(duì)照的Control 組小鼠,提示2 型糖尿病的db/db 小鼠在傷口發(fā)生后的修復(fù)進(jìn)程中會(huì)全程伴隨著局部的微循環(huán)障礙這一問題。同時(shí),本研究ELISA結(jié)果也揭示,對(duì)于血管新生起重要作用的細(xì)胞因子VEGF的表達(dá),db/db小鼠在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于Control 組小鼠,進(jìn)一步揭示了2 型糖尿病小鼠會(huì)發(fā)生血管新生能力的顯著降低。而本研究也發(fā)現(xiàn),EGCG(10 mg/kg)治療在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著提高db/db 小鼠傷口位置的局部血流速度;同時(shí),EGCG 治療也在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)顯著提升了db/db 小鼠傷口位置VEGF的表達(dá)。本研究結(jié)果提示,EGCG能夠顯著改善2型糖尿病創(chuàng)傷部位的局部微循環(huán)狀態(tài),促進(jìn)傷口處的血管新生。
炎癥反應(yīng)是軟組織的創(chuàng)傷發(fā)生過程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),而諸多先前的研究表明2 型糖尿病傷口愈合修復(fù)中長期處于高炎癥反應(yīng)狀態(tài),這會(huì)顯著降低其傷口的修復(fù)速率[20]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠傷口位置的炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Control 組小鼠,提示2 型糖尿病的db/db小鼠在創(chuàng)傷發(fā)生后長期處于局部高炎癥反應(yīng)狀態(tài)。而EGCG(10 mg/kg)治療在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低了db/db 小鼠傷口處IL-1β、IL-6和TNF-α水平。本研究結(jié)果提示,EGCG的促2型糖尿病傷口愈合效應(yīng)與其顯著的抗炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
綜上所述,本研究通過形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)等角度系統(tǒng)揭示了EGCG能夠有效改善2型糖尿病db/db 小鼠的傷口愈合能力,而這一積極效應(yīng)與EGCG顯著的抗炎癥反應(yīng)、促血管新生、加速膠原沉積密切相關(guān)。本研究提示EGCG作為一種經(jīng)濟(jì)易得的中藥成分,具有可觀的治療2 型糖尿病傷口愈合障礙的臨床應(yīng)用前景。