甘菊提取物對(duì)乙醇毒性損傷紅細(xì)胞變化的影響

晏峰 周穎 戴數(shù) 任振喚

酒精（乙醇，ethanol，EtOH）是最常見(jiàn)的濫用物質(zhì)，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期酗酒者可致高血壓、精神失常、肝臟和胃受損等多種疾患[1]，故酒精攝入的毒性反應(yīng)對(duì)機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的功能存在復(fù)雜影響，從各系統(tǒng)比較來(lái)看，血液系統(tǒng)中以外周血象的變化表現(xiàn)最為敏感[2]。研究證實(shí)酒精對(duì)紅細(xì)胞毒性歸因于活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生增加[3-4]，ROS參與多種過(guò)程，如衰老和疾病[5]。ROS的增加可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激和紅細(xì)胞成分的氧化，引起結(jié)構(gòu)和功能改變，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡[6]。甘菊是一種屬菊科的藥用植物，以往實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，其大部分藥理作用與抗氧化活性有關(guān)，這主要是由于其具有清除自由基和（或）抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力[7-8]。筆者擬從乙醇對(duì)紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性方面入手，探討甘菊提取物（chamomile decoction extract，CDE）對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用，以抗壞血酸作為CDE的藥效評(píng)價(jià)，為有效分析、預(yù)防及治療乙醇對(duì)紅細(xì)胞毒性損傷提供新方向。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取本院急診科2017年9月至2018年5月收治的急性酒精中毒患者256例，男157例，女99例，年齡 25耀59（40.96依12.83）歲；同時(shí)選取本院同期健康體檢者85例作為對(duì)照組，男50例，女35例，年齡22耀57（38.75依11.79歲），均無(wú)貧血及其他血液系統(tǒng)疾病，無(wú)急性感染、無(wú)飲酒習(xí)慣。全部對(duì)象均獲知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組對(duì)象性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器和試劑 儀器：（1）美國(guó)coulter LH750 analyzer全自動(dòng)血液分析儀及儀器配套稀釋液、溶血?jiǎng)⑶鍧嵰?；?）美國(guó)Agilent 7890型頂空氣象色譜儀；（3）上海儀器總廠723型分光光度計(jì)；（4）美國(guó)BECKMAN AU5821型全自動(dòng)生化分析儀。試劑：抗壞血酸購(gòu)自天津市化學(xué)試劑一廠；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（cata原lase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxi原dase，GSH-Px）巰基（sulfhydryl，-SH）測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集和檢測(cè) 所有研究對(duì)象收治后抽取靜脈血8 ml，其中2 ml用EDTANa2抗凝，用于血常規(guī)檢測(cè)，2 h內(nèi)完成；2 ml與枸櫞酸鈉9:1混勻，用于滲透脆性實(shí)驗(yàn)；其余EDTANa2抗凝用于血液中乙醇含量及紅細(xì)胞生化指標(biāo)測(cè)定，血液中乙醇含量使用頂空氣相色譜法檢測(cè)；723分光光度計(jì)用于50%溶血百分率檢測(cè)；酶活性檢測(cè)在生化分析儀上進(jìn)行。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 CDE溶液配制 分別稱取1 g CDE，加入100滋l二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）使其充分溶解后加入甲醇配成1 000 mg/L的CDE原液，給藥時(shí)用甲醇加以稀釋，配制成終濃度為25、50、100 mg/L的不同稀釋液?？箟难崛芤阂喟瓷鲜龇椒ㄅ渲瞥山K濃度為200 mg/L。

1.3.2.2 乙醇不同濃度紅細(xì)胞懸液的配制 收集0 mg/100 ml、10 mg/100 ml、80 mg/100 ml、100 mg/100 ml、200 mg/100 ml急性酒精中毒患者的抗凝全血，3 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，加1豫氯化鈉溶液洗滌 2次，將細(xì)胞稀釋成 l伊l06個(gè)/ml，備用。

1.3.2.3 乙醇不同時(shí)間紅細(xì)胞懸液的配制 收集乙醇含量為80 mg/100 ml的急性酒精中毒患者的抗凝全血，孵育 12、24、36、48、60 h 后 3 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液，加1豫氯化鈉溶液洗滌2次，將細(xì)胞稀釋成 1伊l06個(gè)/ml，備用。

1.3.3 滲透脆性試驗(yàn) 取試管14只，按表1編號(hào)排列，加入試劑和紅細(xì)胞進(jìn)行滲透脆性試驗(yàn)，具體步驟如下，輕輕混勻，置室溫2 h，然后2 000 r/min離心5 min，沉淀觀察結(jié)果。上清液出現(xiàn)透明、紅色，管底有紅細(xì)胞沉淀管為開(kāi)始溶血管；管底無(wú)紅細(xì)胞沉淀管為完全溶血管。

1.3.4 溶血百分率計(jì)算 以510 nm比色，第1管為空白管，第14管NaCl濃度為0.1豫作為完全溶血管。其他各管上清液的吸光度與第14管上清液的吸光度比較，算出其溶血百分率。溶血百分率（%）=A測(cè)定管/A完全溶血管 伊100%。

表1 紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)操作步驟（ml）

1.3.5 紅細(xì)胞滲透脆性曲線繪制 以溶血百分率為縱坐標(biāo)、NaCl濃度為橫坐標(biāo)，繪制紅細(xì)胞鹽水滲透脆性曲線，在曲線上找出50豫溶血百分率的NaCl濃度，其結(jié)果為滲透中數(shù)（MCF）。

1.3.6 預(yù)處理及酶活性測(cè)定 第1管選取乙醇含量為0 mg/100 ml者作為對(duì)照組，加入雙蒸水及與2-6管乙醇等體積的0.9%氯化鈉；2～6管乙醇含量為80 mg/100 ml，設(shè)定第2管為乙醇毒性損傷組，加入雙蒸水；3～5管加入不同劑量 CDE（終濃度分別為 25、50、100 mg/L），第6管加入200 mg/L抗壞血酸。第3～6管預(yù)處理4 h，第6管作為陽(yáng)性對(duì)照。溶血后3 000 r/min離心5 min，取上清液檢測(cè)紅細(xì)胞 MDA、-SH基團(tuán)含量和 SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.3.7 紅細(xì)胞 MDA、-SH含量測(cè)定和 SOD、CAT、GSH-Px活性檢測(cè) MDA含量檢測(cè)采用硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid，TBA）法檢測(cè)，結(jié)果以 pmol/mg protein表示；-SH基團(tuán)含量檢測(cè)采用分光光度法檢測(cè)，結(jié)果以nmol/mg protein表示；SOD活性檢測(cè)采用四氮唑藍(lán)（NBT）法檢測(cè)，結(jié)果以U/mg protein表示；CAT活性檢測(cè)采用紫外吸收法檢測(cè)，結(jié)果以nmolH2O2/min·mg protein表示；GSH-Px活性檢測(cè)采用酶促法測(cè)定，結(jié)果以nmol GSH/min·mg protein表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用字2檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性酒精中毒患者與對(duì)照組血常規(guī)結(jié)果的比較 進(jìn)行不同乙醇濃度血樣外周血檢測(cè)變化，發(fā)現(xiàn)急性酒精中毒患者血液中的WBC、PLT低于對(duì)照組，淋巴細(xì)胞百分比（LY）、平均紅細(xì)胞容積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）值明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見(jiàn)表 2。

2.2 乙醇對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性影響的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 乙醇攝入量對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性影響 隨著乙醇含量的增加，紅細(xì)胞滲透脆性逐漸增加，乙醇組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），不同乙醇含量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。見(jiàn)表3。

2.2.2 乙醇孵育時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性影響 乙醇組紅細(xì)胞滲透脆性隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，乙醇組與同一時(shí)段對(duì)照組相比，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）：乙醇組不同孵育時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)。見(jiàn)表4。

2.3 乙醇和CDE對(duì)紅細(xì)胞脂質(zhì)氧化的影響 紅細(xì)胞脂質(zhì)氧化以MDA表示。乙醇攝入量過(guò)多增加紅細(xì)胞MDA水平（圖1）。然而經(jīng)過(guò)CDE預(yù)處理后顯示以劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)乙醇中毒引起的脂質(zhì)過(guò)氧化（P＜0.01）。

2.4 乙醇和CDE對(duì)紅細(xì)胞-SH基團(tuán)含量的影響 本研究顯示乙醇攝入顯著降低-SH基團(tuán)含量（圖2），CDE預(yù)處理顯著并劑量依賴性地減緩紅細(xì)胞由于乙醇的氧化應(yīng)激引起的消耗（P＜0.01）。

2.5 乙醇和CDE對(duì)紅細(xì)胞抗氧化活性作用的影響酶研究發(fā)現(xiàn)乙醇和CDE對(duì)紅細(xì)胞抗氧化酶活性有較大影響（圖3）。說(shuō)明乙醇攝入顯著降低紅細(xì)胞抗氧化酶活性SOD（a）、CAT（b）和 GPx（c）（P＜0.01）。CDE 預(yù)處理明顯逆轉(zhuǎn)所有乙醇誘導(dǎo)的抗氧化劑酶消耗，并且以劑量依賴方式保護(hù)紅細(xì)胞免于乙醇的氧化（P＜0.01）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗壞血酸（抗氧化物質(zhì)），也表現(xiàn)出同樣的保護(hù)方式。

表2 急性酒精中毒患者與對(duì)照組血常規(guī)結(jié)果的比較

表3 不同乙醇含量對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性影響的檢測(cè)結(jié)果

圖1 乙醇（EtOH）和甘菊提取物（CDE）對(duì)丙二醛（MDA）的影響（AA為抗壞血酸；與對(duì)照組相比，*P＜0.01；與乙醇毒性損傷組相比，△P＜0.05）

圖2 乙醇（EtOH）和甘菊提取物（CDE）對(duì)-SH的影響（AA為抗壞血酸；與對(duì)照組相比，*P＜0.01；與乙醇毒性損傷組相比，△P＜0.05）

圖3 乙醇（EtOH）和甘菊提取物（CDE）對(duì)SOD、CAT和GPx活性的影響（a：SOD；b：CAT；c：GPx；AA 為抗壞血酸；與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與乙醇毒性損傷組比較，△P＜0.05）

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)隨著飲酒頻率和飲酒量的增加，紅細(xì)胞和Hb水平趨于越來(lái)越高，顯示乙醇對(duì)紅細(xì)胞生成和生理活性有不同程度的影響[9]；另有研究發(fā)現(xiàn)乙醇攝入可引發(fā)全身（血液血漿）和局部水平（紅細(xì)胞）的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化的激活[10]，導(dǎo)致紅細(xì)胞代謝活動(dòng)出現(xiàn)障礙[11]。本研究亦證實(shí)，隨著乙醇含量的增加和乙醇續(xù)存時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞滲透脆性明顯降低，這可能與乙醇致紅細(xì)胞膜組分、膜功能改變有關(guān)[12]，而這種變化會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低、變形性下降，即紅細(xì)胞通過(guò)微小血管的能力降低，導(dǎo)致組織灌注不足[13]，影響臟器的正常生理功能，因此認(rèn)為乙醇攝入量、時(shí)間不同對(duì)外周血或機(jī)體有影響[9]。

相關(guān)研究顯示乙醇誘導(dǎo)組織氧化應(yīng)激表現(xiàn)在許多器官如肝、腎、心臟、腦、和紅細(xì)胞等[14-17]。乙醇代謝消耗過(guò)程中，通過(guò)相關(guān)機(jī)制氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS[18]，ROS是一類含有未配對(duì)電子的氧原子或氧原子團(tuán)，會(huì)攻擊包括紅細(xì)胞在內(nèi)生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生MDA[19-20]，MDA極易與細(xì)胞膜磷脂、蛋白質(zhì)等發(fā)生羰-氨交聯(lián)反應(yīng),具有強(qiáng)生物毒性的羰基化合物，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞和生理功能的喪失，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和老化死亡[21-22]。因此當(dāng)紅細(xì)胞MDA含量增加，表明紅細(xì)胞抗氧化防御能力下降，間接證實(shí)機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊，出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)[18]。本研究證實(shí)，乙醇誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過(guò)CDE預(yù)處理后得到緩解，因此認(rèn)為CDE可以在一定程度上保護(hù)紅細(xì)胞脂質(zhì)氧化。

在紅細(xì)胞膜上，-SH大量存在于多種功能蛋白中，而且多種代謝酶類都以包含-SH的半胱氨酸作為必須氨基酸。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，-SH易發(fā)生自氧化交聯(lián)形成二硫鍵-S-S-，使蛋白分子內(nèi)或分子間交聯(lián)[23]，導(dǎo)致多種蛋白及酶的功能降低或失活，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂[10]。已有研究表明[24-25]，人紅細(xì)胞膜蛋白-SH水平在維系紅細(xì)胞功能的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，蛋白-SH交聯(lián)所導(dǎo)致多種膜蛋白的損傷是紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能性損傷的重要原因。本研究中，乙醇攝入組紅細(xì)胞膜-SH含量顯著降低（P＜0.01），一方面，表明紅細(xì)胞膜蛋白通過(guò)膜上大量-SH基團(tuán)抵抗氧化損傷能力的降低；另一方面，也意味著紅細(xì)胞膜蛋白發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的改變。本研究結(jié)果顯示，CDE在一定程度上顯著提高紅細(xì)胞-SH含量，顯著保護(hù)相關(guān)酶活性，提示CDE通過(guò)抑制-SH的氧化，阻止膜蛋白交聯(lián)可能是對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制之一[7-8]。

乙醇代謝消耗過(guò)程中氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS[18]。ROS對(duì)細(xì)胞生物大分子（如脂類、蛋白質(zhì)、DNA）有潛在的氧化損傷能力，具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性[26-27]。正常情況下，由于機(jī)體內(nèi)存在大量抵抗和消除自由基損傷的機(jī)制，ROS不會(huì)引起組織器官的損傷[28]。紅細(xì)胞內(nèi)存在酶類和非酶類抗氧化物在內(nèi)的抗氧化體系[29]，SOD、CAT和GSH-Px是體內(nèi)主要的抗氧化酶，3者之間共同形成體內(nèi)抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用[10]。當(dāng)紅細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多，不能被及時(shí)清除，SOD、CAT和GSH-Px活性降低，無(wú)法繼續(xù)抵御持續(xù)產(chǎn)生的ROS，加重細(xì)胞損傷。本研究顯示，CDE能夠有效改善以上3種抗氧化酶的活性，降低ROS的產(chǎn)生，提示CDE能夠阻斷氧自由基對(duì)紅細(xì)胞的破壞，起到抗氧化作用。

綜上所述，CDE對(duì)乙醇致氧化損傷人紅細(xì)胞具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)抗氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)細(xì)胞膜蛋白上的巰基與細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，CDE高劑量組對(duì)人紅細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用與抗壞血酸大體相當(dāng)。