3,5-二硝基水楊酸法測定液體糖中總糖含量

詹夢濤,婁水珠,劉仙花,洪耀強,楊海英,杜 剛

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500；2.云南民族大學 化學與環(huán)境學院,云南 昆明 650500)

液體糖是以白砂糖、綿白糖、精制的糖蜜或中間制品為原料,經(jīng)加工或轉(zhuǎn)化工藝制煉而成,根據(jù)其中還原糖的含量不同可分為全蔗液體糖和轉(zhuǎn)化液體糖[1].液體糖作為白砂糖的替代品應用于食品工業(yè),在歐美國家液體糖的生產(chǎn)和應用已有悠久的歷史.隨著國內(nèi)飲料食品行業(yè)的發(fā)展,對液體糖的需求也在不斷增長.

液體糖中的總糖主要指具有還原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在測定條件下能水解為還原性單糖的蔗糖、麥芽糖等.還原糖和總糖含量是影響液體糖質(zhì)量和區(qū)分種類的重要指標之一.目前,我國于2011年實施的QB/T 4093—2010液體糖輕工業(yè)行業(yè)標準中[1],規(guī)定轉(zhuǎn)化糖漿的還原糖測定方法按照QB/T2343.2—1997標準[2]或者GB/T18932.22—2003 標準[3].QB/T 2343.2—1997標準中還原糖的測定方法為蘭-艾農(nóng)恒容滴定法,操作步驟繁瑣、影響因素多,同時本試驗液體糖樣品本身顏色較深,滴定終點受干擾肉眼很難判定；而GB/T18932.22—2003 標準中還原糖為高效液相色譜示差折光檢驗方法,設備費用高、測樣周期長,不適合大批量的樣品測定,用于測量全蔗糖糖漿的還原糖含量存在較大誤差[4],也不適合轉(zhuǎn)化糖漿中還原糖的測定[5].3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法是測定還原糖的經(jīng)典方法,操作簡便快速,設備要求簡單,適宜批量檢測.由于沒有還原性的雙糖和多糖可以通過酸水解徹底水解成有還原性的單糖,DNS法也廣泛用于中藥材、葡萄酒等樣品水解后總糖的含量測定[6-10].

本文以市售液體糖為原料,利用鹽酸將糖漿中總糖水解為還原糖,堿性條件下還原糖將DNS中的硝基還原成桔紅色氨基化合物,氨基化合物在一定波長下的吸光度與還原糖含量存在線性關系從而計算總糖含量[11]考察了檢測波長、顯色劑用量、沸水浴加熱時間、顯色時間等還原糖的檢測條件,對液體糖中總糖的水解條件進行優(yōu)化,首次建立DNS法檢測液體糖中總糖含量的方法,并做了相應的方法學考察研究,以期為液體糖的研發(fā)和生產(chǎn)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

某品牌液體糖,購自本地超市.

D-無水葡萄糖對照品(分析純)：風船化學試劑科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸(分析純)：津東天正精細化學試劑廠；氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉(均為分析純)：風船化學試劑科技有限公司；鹽酸(分析純)：重慶川東化工有限公司；濃硫酸(分析純)：成都市科龍化工試劑廠.

1.2 儀器與設備

UV-9000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；METTLERTOLEDO LE204E型精密電子天平：美特勒-托利多儀器上海有限公司；100～1 000 μL 移液槍：普蘭德(上海)貿(mào)易有限公司；HH-S2 電熱恒溫水浴鍋：江蘇大地自動化儀器廠；BCD-218ZM2冰箱：合肥美菱股份有限公司.

1.3 溶液的配制

DNS試劑的配制[12]：稱取3,5-二硝基水楊酸3.15 g ,量取2 mol/L NaOH 溶液131 mL,加至250 mL含有 92.5 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,加入 2.5 g苯酚和 2.5 g 亞硫酸鈉,溶解后冷卻至室溫,用蒸餾水定容至 500 mL.貯存于棕色瓶中,放置一周后使用.

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取無水葡萄糖0.1 g,加蒸餾水定容至100 mL容量瓶中,備用.

液體糖樣品溶液：準確稱取液體糖樣品1 g,加蒸餾水稀釋,搖勻,定容至250 mL容量瓶中備用.

1.4 檢測條件的優(yōu)化

1.4.1 檢測波長考察

取4支25 mL具塞比色管編號分別為1、2、3、4.

1：精密吸取1.5 mL蒸餾水,加1.5 mL DNS試劑；

2：精密吸取1.0 mL液體糖樣品溶液,加入2 mol/L鹽酸0.5 mL,50 ℃水浴加熱5 min進行酸水解,酸水解后冷卻,用 2 mol/L 的 NaOH 溶液中和,加1.5 mL DNS試劑；

3：精密吸取1.0 mL液體糖樣品溶液,加入2 mol/L 鹽酸 0.5 mL,50 ℃水浴加熱 5 min進行酸水解,酸水解后冷卻,用 2 mol/L 的 NaOH 溶液中和,加1.5 mL蒸餾水；

4：精密吸取1 mg/mL葡萄糖標準品溶液 1.0 mL,分別加入1.5 mL DNS試劑、0.5 mL蒸餾水.

1、2、3、4比色管置于沸水浴中反應7 min,迅速冷卻至室溫,搖勻,定容至刻度,顯色30 min；1、3兩組以蒸餾水作參比,2、4兩組以DNS試劑-水(1號)作參比,在波長400～700 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,每隔1 nm采集吸光度數(shù)據(jù).分析光譜掃描圖,確定檢測波長.

1.4.2 DNS法檢測條件的考察

25 mL比色管中分別加入1 mL 1 mg/mL葡萄糖溶液,考察顯色劑添加量(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7 mL)、沸水浴加熱時間(1、3、5、7、9、11 min)、顯色時間(10、20、30、40、50、60 min)在1.4.1 確定波長下檢測吸光度值.

1.5 液體糖總糖水解條件考察

在利用 DNS 法測定總糖時,酸水解時既要保證多糖 100% 水解,也要避免果糖等在酸水解過程中進一步被降解[13].影響水解的因素主要有水解時間、水解溫度、酸的添加量.本實驗選擇2 mol/L 的鹽酸溶液作為水解液體糖糖類的酸,試驗考察的因素為水解時間、水解溫度及鹽酸添加量3個因素.酸水解條件設置見表 1.

表1 酸水解條件

1.6 標準曲線的繪制

分別精密吸取1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液0.10、0. 20、0.40、0.60、0.80、1、1.2、1.4 mL加入25 mL 比色管中,加入1.5 mL的DNS,加蒸餾水至10 mL,在沸水浴中加熱7 min,迅速冷卻,定容,顯色30 min.以 DNS-水溶液為空白,在 1.4.1 確定波長下測定吸光度.以葡萄糖質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線.

1.7 總糖含量的測定及計算方法

精密量取液體糖樣品溶液1 mL于25 mL比色管中,加入2 mol/L鹽酸0.5 mL(糖液與酸液體積比為1∶0.5),放入50 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min進行酸水解,酸水解后冷卻,用 2 mol/L 的 NaOH 溶液中和,加 1.5 mL DNS溶液,搖勻后在沸水浴中加熱7 min,迅速冷卻,定容,顯色30 min. 以DNS試劑-水為空白對照,測定吸光度.按下式計算樣品中總糖的百分含量(以葡萄糖計)[11]：

總糖含量(%)=(ρ×V÷M) ×0.9 ×100

式中ρ為葡萄糖標準曲線方程計算所得液體糖中葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為液體糖稀釋定容的體積(mL)；M為液體糖樣品毫克數(shù),0.9為以葡萄糖計算液體糖總糖含量的換算系數(shù).

2 結果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化結果分析

2.1.1 檢測波長的選擇

根據(jù)1.4.1步驟,分別將1、2、3、4比色管在波長400～700 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,光譜掃描圖如圖1.

從圖 1 中可以看出,葡萄糖溶液-DNS(4)與液體糖樣品-DNS(2)的最大吸收波長為491 nm.但DNS 試劑(1)在此處也有較強的吸收,使得樣品在 491 nm 處的測定干擾嚴重.當波長為500 nm時,DNS-水(1)與液體糖樣品-水(3)的吸收較小,對樣品測量干擾較小.綜合考慮選擇測定波長為500 nm.與文獻中采用的波長480、520、530、540 nm[9-10,14-15]不同.

2.1.2 顯色劑用量的確定

由圖2可知,顯色劑DNS用量在0.3～1.5 mL范圍時,吸光度呈上升趨勢,當用量達到1.5 mL 時,吸光度達到最大值；在1.5～2.7 mL范圍時,吸光度值基本不變.顯色劑DNS的用量確定為1.5 mL.

2.1.3 沸水浴加熱時間考察

圖3結果顯示,當沸水浴加熱時間為7 min時反應完全,吸光度有最大值,7 min以后,吸光度值基本不變,確定7 min為沸水浴加熱時間.

2.1.4 顯色時間的選擇

考察顯色時間對葡萄糖溶液在波長500 nm處吸光度值的影響,結果如圖4.由圖4可知,當顯色時間到30 min時,吸光度有最大值,30 min后吸光度值基本穩(wěn)定,選擇30 min 為最終顯色時間.

2.2 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線如圖5所示.標準曲線的線性回歸方程為：y=0.709x-0.047,R2=0.999,在0.1～1.4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好.

2.3 總糖水解條件優(yōu)化結果與分析

2.3.1 鹽酸添加量的考察

圖6結果顯示,當鹽酸用量為0.5 mL時,吸光度值達到最大,鹽酸用量大于0.5 mL時,吸光度值反而有所下降,參照文獻[13].此時可能部分果糖降解引起吸光度值下降.確定鹽酸用量為0.5 mL(糖液與酸液體積比為1∶0.5).

2.3.2 酸水解溫度的考察

由圖7可知,當酸水解溫度為50 ℃時,吸光度達到最大,表明此時多糖水解完全,選擇50 ℃為最終酸水解溫度.

2.3.3 酸水解時間的考察

圖8結果顯示,當酸水解時間為0～5 min時,溶液的吸光度值不斷增大；當沸酸水解時間超過 5 min 時,吸光度值迅速下降,表明酸水解時間對吸光度的測量影響較大.最終確定酸水解時間為5 min.

2.4 總糖含量的測定及計算

按照1.7步驟對液體糖樣品中的總糖含量進行測定及計算,結果表明液體糖樣品中總糖含量為69.65%(n=3).

2．5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗

精密移取1mL液體糖樣品溶液于6份25 mL具塞比色管中,按照1.7方法處理,測定吸光度.測定結果相對標準偏差為1.62%.

2.5.2 重復性試驗

分別稱取6份約1 g 的液體糖樣品于250 mL 容量瓶中,定容,按照1.7方法測定樣品溶液的吸光度,計算液體糖樣品中總糖的百分含量.計算結果相對標準偏差為2.18%.

2.5.3 穩(wěn)定性試驗

移取液體糖樣品溶液1.0 mL于25 mL具塞比色管中,按照1.7方法測定樣品溶液的吸光度,每隔5 min 測定1次吸光度.吸光度6次檢測結果相對標準偏差為1.91%.表明用DNS法測定液體糖總糖含量在30～60 min內(nèi)顯色穩(wěn)定.

2.5.4 加標回收率試驗

精密吸取液體糖溶液5份各1 mL,分別加入5份不同體積的1.0 mg/mL葡萄糖溶液,進行加標回收率試驗,按照1.7方法測定樣品溶液的吸光度,計算回收率及相對標準偏差,結果如表2所示.總糖含量檢測結果回收率在96.90%～104.37%,平均回收率為99.56%,RSD值為3.16%.

表2 加標回收率試驗結果

3 結語

本文對液體糖中還原糖的檢測條件和總糖的水解條件進行了優(yōu)化,建立了3,5-二硝基水楊酸法測定液體糖中總糖含量.確定DNS法測定液體糖中還原糖的檢測條件為：檢測波長500 nm,沸水浴加熱7 min,DNS顯色劑1.5 mL,顯色時間 30 min；總糖的水解條件為：糖液樣品與 2 mol/L 鹽酸體積比為1∶0.5, 50 ℃水解5 min. 標準品葡萄糖在0.1～1.4 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關系,相關系數(shù)R2=0.999； 試驗精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗結果的相對標準偏差均小于3%,平均加標回收率為99.56%,RSD值為3.16%.結果表明方法可用于檢測液體糖中總糖含量.