類鼻疽實(shí)驗(yàn)室診斷的研究進(jìn)展*

許珊珊，陳鑫蘋，肖 斌 綜述，符生苗△ 審校

1.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,海南?？?570311；2.海南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科/海南熱帶腫瘤研究所，海南?？?570312；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部,廣東清遠(yuǎn) 511518

類鼻疽伯克霍爾德菌(Bp)是一種引起類鼻疽病的高致病性細(xì)菌，主要流行于東南亞及澳大利亞北部。近些年非流行地區(qū)零星報道病例增多，據(jù)估計，類鼻疽病每年造成的全球疾病負(fù)擔(dān)約為165 000例，其中89 000例死亡[1]。類鼻疽感染與職業(yè)及自身基礎(chǔ)疾病存在相關(guān)性。在高危人群中糖尿病為關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的易感因素，超過50%的類鼻疽患者都存在糖尿病[2-3]。類鼻疽平均潛伏期為9 d，但也有感染長達(dá)20年后發(fā)病，即所謂“潛伏型類鼻疽”。其臨床表現(xiàn)差異大，包括皮膚和軟組織膿腫、肺炎和感染性休克，后者的病死率超過80%，一半的類鼻疽死亡發(fā)生在就診后的前48 h內(nèi)[4]。由于缺乏快速的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，只能通過臨床癥狀及流行病學(xué)史經(jīng)驗(yàn)性地進(jìn)行靶向治療。該細(xì)菌對多種抗菌藥物存在天然耐藥，使用無效的抗菌藥的治療可能導(dǎo)致病死率(CFR)超過70%。面對非特異性的臨床表現(xiàn)，及早診斷顯得尤為重要，故本文將對類鼻疽的實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行介紹。

1 分離培養(yǎng)法

當(dāng)前診斷類鼻疽的金標(biāo)準(zhǔn)仍是細(xì)菌培養(yǎng)。將被正常菌群污染的樣本接種到選擇性培養(yǎng)基(如Ashdown瓊脂或洋蔥伯克霍爾德菌瓊脂)上，提高了被正常菌群污染的標(biāo)本中Bp檢出率[5]。培養(yǎng)法需要經(jīng)驗(yàn)豐富的微生物學(xué)家和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室安全程序，耗時長、靈敏度差、陽性率低、早期診斷易漏診。使用生化表型鑒定系統(tǒng)進(jìn)行識別診斷的準(zhǔn)確性約為80%，VITEK 2系統(tǒng)常將Bp誤認(rèn)為洋蔥伯克霍爾德菌，且該系統(tǒng)在屬級水平上的錯誤識別率很高。API 20NE系統(tǒng)具有明顯的地域差異，Bp通常被錯誤鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌或紫色色桿菌，且該系統(tǒng)需要至少24 h才能得出結(jié)果，作為篩選方法不太令人滿意[6-7]。

2 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測易于執(zhí)行且價格低廉，可以減少實(shí)驗(yàn)室診斷的時間。即時診斷是早期診斷的關(guān)鍵，近些年正在開發(fā)和評估越來越多的非培養(yǎng)類鼻疽快速診斷技術(shù)，血清學(xué)檢測用于開發(fā)即時診斷具有更廣闊的前景。目前血清學(xué)檢測主要包括間接血凝試驗(yàn)(IHA)[8]、乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)[9-10]、免疫熒光分析(IFA)[11-12]、快速免疫色譜檢測(ICT)[13]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、側(cè)向流動免疫測定法(LFI)[14]和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)[15]等。

IHA由于靈敏度不高，且對感染銅綠假單胞菌患者檢測結(jié)果存在假陽性，因此該方法僅用于沒有類鼻疽流行地區(qū)居住史并且曾進(jìn)行過一次或少量離散到訪而可能發(fā)生暴露的旅行者。LAT與泰國伯克霍爾德菌和洋蔥伯克霍爾德菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)，只能作為一種初篩試驗(yàn)[10]。雖然IFA法具有較佳的靈敏度(92.6%)及特異度(100.0%)但不能直接檢測全血或血清樣本，且對設(shè)備及人員有較高的要求，適合在初篩的基礎(chǔ)上使用該方法作為判斷依據(jù)。ICT檢測的是溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp1)的IgG抗體，其操作簡便、耗時短，可用于流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場診斷。雖然Hcp1已被證實(shí)是宿主體液免疫反應(yīng)的重要靶標(biāo)，但在免疫功能低下或診斷時間過早時均有可能出現(xiàn)假陰性[16]。針對性地檢測Hcp1的IgM是否會提高類鼻疽診斷的靈敏度和特異度，或運(yùn)用Hcp1的IgG和IgM能否可靠區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染有待進(jìn)一步研究。

外膜蛋白(ompA)[17]、伴侶蛋白(rGroEL)[17]、莢膜多糖(CPS)[18]、O-多糖(OPS)[18]、鞭毛蛋白(FLAG300)、Hcp1[19]等是常用的Bp抗原，其中Hcp1及OPS是開發(fā)快速即時檢測的具有前景的候選靶抗原。處在流行地區(qū)的人群血清背景陽性率高，rGroEL在健康人群中表現(xiàn)出較少的抗體反應(yīng)，這一特征使其應(yīng)用在流行地區(qū)具有很高的陰性預(yù)測價值，但與假單胞菌屬和其他非發(fā)酵革蘭陰性桿菌(GNF)存在交叉反應(yīng)，需要進(jìn)一步優(yōu)化抗原以提高檢測的準(zhǔn)確性。免疫磁珠(IMB)聯(lián)合ELISA(IMB-ELISA)的方法靈敏度低，耗時久且與大腸桿菌顯示出模糊的交叉反應(yīng)故不推薦使用[20]。單獨(dú)應(yīng)用LFI檢測類鼻疽靈敏度不高，CPS-LFI和Hcp1-ELISA或OPS-ELISA聯(lián)合診斷類鼻疽，可提高檢測的靈敏度[21]。InBios公司開發(fā)的橫向流動檢測法(AMD-LFI)在檢測尿液樣本時顯示假陽性結(jié)果，考慮是源于尿液中的CPS負(fù)荷低，可使用尿液濃縮器提高AMD-LFI的靈敏度[22-23]，隨后優(yōu)化出AMD-Plus檢測系統(tǒng)，測試中未出現(xiàn)早期的假陽性尿帶[24]。Bp CPS半衰期短且可快速排泄至尿液，使用尿液檢測的AMD-LFI陽性可提示活動性的類鼻疽感染，根據(jù)這一特點(diǎn)，持續(xù)性檢測AMD-LFI可監(jiān)控患者病情進(jìn)展及用藥療效。

基于20種類鼻疽抗原開發(fā)的蛋白質(zhì)微陣列是對類鼻疽患者血清中短期和長期抗體的多重檢測[15]。其靈敏度(86.7%)明顯高于IHA(57.3%)。標(biāo)準(zhǔn)化的微陣列裝置簡單、檢測方便、速度快，適于常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

3 分子生物學(xué)檢測

由于血清學(xué)檢測方法依賴于抗體滴度，靈敏度及特異度不穩(wěn)定。鑒于病原體檢測的研究熱點(diǎn)應(yīng)是開發(fā)更加簡便的分子生物學(xué)檢測方法，縮短檢測時間且不影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 目前PCR常用靶標(biāo)Ⅲ型分泌系統(tǒng)研究基因簇(TTS1)內(nèi)orf2，最常見的是通過實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)方法直接從臨床樣本中檢測病原體，qPCR是當(dāng)前定量最準(zhǔn)確、重復(fù)性最好的核酸檢測技術(shù)。ZUETER等[25]運(yùn)用TTS1基因簇中的orf1-stcQ作為PCR擴(kuò)增的靶標(biāo)，檢測菌株的靈敏度和特異度均為100.00%，血培養(yǎng)中的檢測限為18.4×105CFU/mL。但是基于單基因檢測會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，開發(fā)多基因多重靶點(diǎn)檢測可以提高靈敏度。SEMAIL等[26]首次篩選Bp的6型分泌系統(tǒng)5(T6SS-5),建立了測定7種基因(tss C-5、tag D-5、tss A-5、hcp -5、tss B-5、tss F-5和vgrG-5)的多重PCR檢測方法。經(jīng)優(yōu)化后臨床分離株的靈敏度為93.80%，特異度為100.00%。7種基因中除tss F-5檢出限為105CFU/mL外，其他靶標(biāo)基因均能檢測到103CFU/mL，這與RPA的靈敏度相當(dāng)。該多重PCR技術(shù)不僅可以應(yīng)用于類鼻疽的實(shí)驗(yàn)室診斷，同時能進(jìn)一步了解Bp的毒力機(jī)制，對類鼻疽的治療提供新的思路。由于該方法未對臨床樣本進(jìn)行檢測，尚不能確定是否所有的Bp都存在T6SS-5基因，對其實(shí)際應(yīng)用的可能性需進(jìn)一步評估。

等溫?zé)岣艚^式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(iiPCR)是一種基于熒光水解探針的低成本的對流PCR，該方法已被開發(fā)應(yīng)用于檢測瘧疾[27]、登革熱病毒[28]等。CHUA等[29]開發(fā)的針對靶標(biāo)bimA基因的iiPCR表現(xiàn)出高度特異度(100.00%)及靈敏度(97.52%)，檢測限為14 ng/μL，bimA在鼻疽伯克霍爾德菌及泰國伯克霍爾德菌中存在明顯差異，這對于區(qū)分與Bp密切相關(guān)的伯克霍爾德菌屬具有極大的價值。便攜的核酸分析儀可利用電池供電，適用于現(xiàn)場診斷。由于該方法檢測的伯克霍爾德菌屬菌株數(shù)量有限，且未對洋蔥伯克霍爾德菌進(jìn)行鑒定，未來應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)iiPCR的特異度。

3.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP) CHANTRATITA等[30]以TTS1基因簇為靶點(diǎn)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測類鼻疽，結(jié)果表明LAMP比qPCR的靈敏度更高,檢測限達(dá)到38 拷貝/反應(yīng)，如將LAMP與納米生物傳感器(LFB)結(jié)合可更便捷地讀取結(jié)果[31]。TZELING等[32]使用兩組不同的引物和特定雙功能寡核苷酸(DFO)建立了一種多重實(shí)時LAMP檢測，可同時檢測類鼻疽和惡性瘧原蟲。DFO-LAMP檢測的DNA的最小濃度為1 fg，比傳統(tǒng)的多重LAMP(10 fg/μL)更敏感，且未發(fā)生交叉反應(yīng)，特異度為100.00%。因此，多重LAMP為核酸診斷技術(shù)提供了一種簡便、可靠、快速、高度靈敏和特異度的方法。

3.3重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA) RPA能夠在25～50 ℃的溫度范圍內(nèi)將DNA擴(kuò)增至可檢測水平，在低資源環(huán)境現(xiàn)場應(yīng)用是一個很大的優(yōu)勢。PENG等[33]通過靶向TTS1-orf2基因建立重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合橫向流動試紙檢測法(LF-RPA)，LF-RPA和qPCR檢測臨床樣本的檢測限均為4.2×103CFU/mL，且LF-RPA對血液中的抑制劑更具耐受性。SAXENA等[34]使用Bp菌株K96243的BPSS1399上游的DNA序列(251 bp)作為靶標(biāo)序列，在血液和尿液樣本中檢測限為4.8×104CFU/mL和4.95×104CFU/mL，與先前的LF-RPA相比表現(xiàn)更佳。氣溶膠污染是困擾核酸檢測的一大難題，在操作時應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)，否則容易造成假陽性，LI等[35]和ZHAO等[36]不僅開發(fā)了一種簡便可視裝備與LF-RPA相結(jié)合既能減少假陽性，而且引物經(jīng)優(yōu)化后的檢測結(jié)果更好，與實(shí)時PCR具有相同的靈敏度，與16S rRNA基因測序結(jié)果無顯著差異，具有高度特異度(100.00%)。與LAMP相比，RPA的引物設(shè)計較為簡便。由此可見，LF-RPA是當(dāng)今基于PCR技術(shù)檢測類鼻疽的替代方法。

3.4多重交叉置換擴(kuò)增(MCDA) WANG等[37]將MCDA技術(shù)與基于納米顆粒的生物傳感器(NB)相結(jié)合，在純培養(yǎng)物DNA的檢測限為10 fg，特異度為100.00%，且經(jīng)臨床樣本評估MCDA-NB的診斷準(zhǔn)確性與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法相符合。MCDA-NB無需使用特殊的儀器設(shè)備便可快速獲取結(jié)果，對于基層及現(xiàn)場應(yīng)用具有極大幫助。

3.5基因測序 16S rRNA基因序列可以有效區(qū)分類鼻疽和鼻疽。對于Bp與泰國伯克霍爾德菌，groEL基因核苷酸序列顯示<97.6%的同一性，具有更高的鑒別價值[38]。全基因測序不僅可以準(zhǔn)確鑒別類鼻疽，及時發(fā)現(xiàn)突變的細(xì)菌，有效指導(dǎo)臨床治療，還可用于尋找傳染源、傳播途徑，預(yù)測疾病傳播風(fēng)險，在流行病防控方面具有重要意義[39]。

3.6自動化分子診斷平臺 GASSIEP等[40]首次使用Panther fusion自動化分子診斷儀器直接檢測全血樣本中的Bp，檢測限為1.64×103CFU/mL，但由于靈敏度較低，該方法僅適用于血培養(yǎng)陽性診斷。自動化分子診斷平臺可以有效降低勞動成本、處理樣本時間、樣本污染風(fēng)險，未來可以尋找其他的分子靶點(diǎn)以提高檢測的靈敏度。

4 其他檢測方法

4.1質(zhì)譜法 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)可以準(zhǔn)確地鑒定Bp并區(qū)分其他的伯克霍爾德菌屬，也可用于流行病學(xué)研究，對Bp及其相關(guān)物種的發(fā)現(xiàn)和分布，還能區(qū)分野生型和突變體。MALDI-TOF MS在澳大利亞和中國的研究具有良好的靈敏度和特異度[41-42]，但由于Bp存在較高的遺傳多態(tài)性，為了進(jìn)一步評估MALDI-TOF MS的準(zhǔn)確性，WATTHANAWORAWIT等[43]在RUO模式下使用Vitek MS創(chuàng)建用于Bp鑒定的超光譜，并針對來自類鼻疽流行的3個國家的分離株進(jìn)行研究，結(jié)果顯示來自東南亞和澳大利亞的分離株100.0%能正確識別。MALDITOF-MS鑒定的準(zhǔn)確性取決于數(shù)據(jù)庫的信息量，需要不斷完善相關(guān)數(shù)據(jù)庫以提升微生物鑒定在臨床中的診斷價值。

4.2上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法(Bps-UPT-LF) 利用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料結(jié)合雙抗體夾心法制備出Bps-UPT-LF類鼻疽檢測試紙，該技術(shù)靈敏度高，且對104～107CFU/mL的Bp可進(jìn)行精準(zhǔn)定量[44]?；贐ps-UPT-LF試紙耐受性強(qiáng)、操作簡便、快速，運(yùn)用于現(xiàn)場環(huán)境檢測更有優(yōu)勢。

4.3支持向量機(jī)(SVM) 研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平的變化與類鼻疽發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[45]。鑒于以上特點(diǎn)，XU等[46]建立了由CD8+T細(xì)胞、靜息CD4+記憶T細(xì)胞、單核細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞組合而成的新型SVM模型用于檢測敗血癥性類鼻疽。該方法的成本相對較低，表現(xiàn)出高度特異度及靈敏度，可以作為改進(jìn)類鼻疽檢測和診斷的補(bǔ)充。

5 結(jié)語與展望

隨著人口和病原體的移動增加了新地區(qū)流行的風(fēng)險，類鼻疽的全球負(fù)擔(dān)不斷增加。對類鼻疽的診斷不應(yīng)局限于臨床樣本，環(huán)境樣本也應(yīng)納入考慮，對環(huán)境進(jìn)行檢測可以擴(kuò)大類鼻疽的全球風(fēng)險圖，有效監(jiān)控疾病的發(fā)生。預(yù)防和降低受影響個體的死亡率是類鼻疽研究的兩個關(guān)鍵課題?？焖賹?shí)驗(yàn)室診斷有助于早期使用恰當(dāng)?shù)目咕幬镞M(jìn)行治療，從而可能降低因延遲治療而導(dǎo)致的死亡率。實(shí)現(xiàn)對類鼻疽的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是當(dāng)前及未來的努力目標(biāo)。由于目前還沒有市售且可靠的類鼻疽即時診斷技術(shù)，因此開發(fā)簡便、靈敏，能夠快速識別分離株并直接檢測臨床標(biāo)本的診斷方法是未來主要的研究方向，其中，優(yōu)化出簡便的分子生物學(xué)方法將對類鼻疽流行地區(qū)和資源匱乏地區(qū)的病情進(jìn)行監(jiān)控，提供有效治療，遏制疾病的蔓延均有極大的幫助。