酶解牛骨肽促進(jìn)骨骼生長功效的研究

陳麗娜 溫宇旗 韓國慶 王耀新 王繼明 杜芳 魏鵬飛 李穎 蘇秀蘭

摘 要：采用低鈣鼠糧飼喂Wistar大鼠，造大鼠低鈣模型，口服給予模型組大鼠酶解牛骨肽3個月，研究酶解牛骨肽對低鈣大鼠促進(jìn)骨骼生長的作用，測定各實驗組大鼠體重指數(shù)以及大鼠股骨重量、股骨強(qiáng)度、骨鈣含量及血清鈣離子含量等多項生理生化指標(biāo)，同時做體外細(xì)胞實驗，研究酶解牛骨肽對成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖情況的影響。結(jié)果表明：酶解牛骨肽對低鈣大鼠骨鈣含量水平的升高有明顯作用（P<0.05），酶解牛骨肽可以在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增長，說明酶解牛骨肽在一定程度上能夠促進(jìn)骨骼生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：酶解牛骨;多肽;低鈣模型;成骨細(xì)胞

牛骨肽是酶解法獲得的活性肽，其分子量易控制、沒有苦味、分子量?。ā? 000 U），這些小分子肽不需消化直接吸收，與生物體相容性好，具有優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸的營養(yǎng)功能[1]。相較蛋白質(zhì)抗原性低，不容易出現(xiàn)過敏現(xiàn)象，不容易發(fā)生變性而失去活性，相較于氨基酸風(fēng)味更好，比游離氨基酸容易吸收。它具有良好的溶解性，且耐熱、耐酸性好，同時不同來源和不同酶解工藝得到的小分子肽具有不同的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血糖、降血脂、抗菌、抗衰老、抗氧化、抗癌、抗微生物、抗毒素、增加骨密度、改善骨骼韌性等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼中的蛋白質(zhì)90%為膠原蛋白、骨膠原及軟骨素，可以有效防止老年人隨著年齡增加導(dǎo)致生理性的鈣缺乏，骨膠原減少等現(xiàn)象，能起到促進(jìn)皮層細(xì)胞代謝和防止人體老化的作用[3-5]。大鼠長期低鈣飲食造成的大鼠低鈣模型是目前研究營養(yǎng)因素導(dǎo)致鈣缺乏使用最多的動物模型，本文研究牛骨肽對低鈣模型大鼠增加骨密度的功效。體外細(xì)胞實驗是一種廣泛用于補(bǔ)鈣促進(jìn)骨骼生長研究的實驗方案[6]，該研究為探討骨骼膠原蛋白肽補(bǔ)充機(jī)體鈣質(zhì)，增加骨骼強(qiáng)度，為研究骨骼膠原蛋白肽新功效，及牛骨肽方面的新產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛骨膠原蛋白肽的制備 制備工藝為：牛骨→前處理→脫脂（要求最終脂肪含量<5%→牛骨粉碎→過100目標(biāo)準(zhǔn)篩→提取骨膠料液比1∶ 5→氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8.0→加入2 500U/g胰蛋白酶1%→50 ℃，酶解7 h→沸水高溫滅活10 min→檸檬酸溶液調(diào)pH值至6.0→加入復(fù)配蛋白酶酶解，酶與底物比1%→50 ℃，酶解4 h→沸水高溫滅活10 min→過濾5 000 r/min離心5 min→保留濾液→加少量蒸餾水清洗濾渣→活性炭脫色脫苦→冷凍干燥→牛骨多肽原液，得到的牛骨多肽原液多肽含量為2.1%，其中90%以上的多肽其分子量<1 000U。

1.1.2 試劑 胰蛋白酶，廣西南寧龐博生物有限公司;復(fù)配蛋白酶，安占美-安琪酵母有限公司;硫酸銅、 硫酸鉀、 硼酸、 氫氧化鈉、 濃硫酸、 鹽酸、 溴甲酚綠指示、甲基紅指示劑 （以上試劑均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硝酸、高氯酸、氧化鑭、EDTA、碳酸鈣、鈣標(biāo)準(zhǔn)品，中國化學(xué)計量院;碳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，中國化學(xué)計量院;福林酚試劑盒，北京鼎國;朗迪碳酸鈣D3顆粒，OTC，北京康遠(yuǎn)制藥有限公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號20171207）;低鈣鼠糧、正常鼠糧、MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞，中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心;胎牛血清（FBS），天津市灝洋生物制品科技有限公司;MTT，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司（批號：51L10156）;DMSO、青鏈霉素雙抗、DMEM培養(yǎng)基、胰酶，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 精密卡尺;動物解剖器械;EX125DZH電子天平奧豪斯;紅外石英消化爐SKD-20S2，上海沛歐分析儀器有限公司;SKD-800沛歐自動定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司;LDZM-80KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械;SY-300 型標(biāo)準(zhǔn)分析篩，新鄉(xiāng)市篩分設(shè)備有限公司;XW-80A微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器;FE28數(shù)顯酸度計，梅特勒托利多（中國）公司;BGZ-246 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅;FW500 500 g高速中藥粉碎機(jī)，天津華鑫儀器;YLS-16A小動物骨骼強(qiáng)度測定儀，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司;DG50酶標(biāo)儀，華東電子;XSP-ZCA電子顯微鏡。

1.1.4 實驗動物 出生 4周的斷乳Wistar大鼠72只，清潔級，體重60～75 g，雄性，每組12只。

1.2 方法

1.2.1 Wistar大鼠低鈣模型的建立 參考保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊（2003版）[7]上的方案以及周軼琳等[8]方法，建立低鈣大鼠模型。將出生4周的斷乳Wistar大鼠適應(yīng)1周后，禁食12 h，稱體重，按體重隨機(jī)分組，分籠飼養(yǎng)，實驗設(shè)置：高（2倍中劑量）、中（以人體推薦劑量的5倍設(shè)置劑量）、低劑量組（1/2中劑量），同時設(shè)1個低鈣對照組和與相應(yīng)劑量受試物鈣水平相同的碳酸鈣對照組（如僅設(shè)1個碳酸鈣對照組，推薦設(shè)立與高劑量鈣水平相同的碳酸鈣對照組）。低鈣飼料標(biāo)準(zhǔn)（150 mg鈣/100g飼料），同時飲用去離子水以避免從飲水中獲得鈣。

低鈣對照組（模型組）每天飼喂低鈣鼠糧，飲用去離子水，灌胃給予3.5 mL/（kg·d）蒸餾水，陽性藥物碳酸鈣對照組每天飼喂低鈣鼠糧，飲用去離子水，按83 mg/（kg·d）灌胃給藥;空白組大鼠每天正常飲食，飲用涼白開水，給予3.5 mL/（kg·d）蒸餾水;高、中、低劑量組每天飼喂低鈣鼠糧，飲用去離子水，均按照3.5 mL/（kg·d）給予受試藥物，牛骨酶解肽原液作為中劑量，高劑量在原液的基礎(chǔ)上進(jìn)行2倍濃縮，低劑量在原液基礎(chǔ)上進(jìn)行2倍稀釋（表1）。實驗大鼠飼養(yǎng)3個月，每3 d測1次體重，依據(jù)體重計算給藥劑量。

1.2.2 實驗大鼠股骨重量的測定 給藥飼養(yǎng)3個月后，處死，剝離出右側(cè)股骨，剝離股骨的時候注意要剝離完整的右側(cè)股骨，包括股骨頭部分（圖1）。于105 ℃烤箱中烤至恒重，稱量骨干重。

1.2.3 實驗大鼠股骨強(qiáng)度的測定 首先確定股骨中點：測量股骨全長，通過其中點，沿橫截面方向畫一直線，此為股骨中點（截面），然后使用骨骼強(qiáng)度測定儀，對準(zhǔn)中點位置測試股骨最大載荷。將大鼠骨骼取下后，剔除骨骼上附著的肌肉和韌帶，使其保持清潔干燥，放置于載物架上，蓋上防護(hù)蓋，運(yùn)行儀器，顯示屏上顯示骨骼從中點折斷時所受的壓力，即骨骼的最大橫向承壓力，通過骨骼力學(xué)性能檢測，可以直接反映骨骼強(qiáng)度，間接反映骨密度。該試驗是研究骨質(zhì)疏松的有效手段，可以加快研究速度，降低研究成本，實現(xiàn)快速篩選藥物和食品對骨骼組織影響情況。

1.2.4 大鼠骨鈣含量的測定 骨骼中鈣離子含量的測定，依照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鈣的測定檢測方法——第二法 EDTA滴定法測定[9-10]。鈣與指示劑形成絡(luò)合物，以 EDTA 滴定，在達(dá)到當(dāng)量點時，在適當(dāng)?shù)膒H 范圍內(nèi)，EDTA與鈣形成穩(wěn)定的金屬絡(luò)合物，指示劑游離，此時溶液呈現(xiàn)游離指示劑的顏色，所以根據(jù)EDTA用量，計算鈣的含量。試樣中鈣的含量按式（1）計算：

式（1）中：X——試樣中鈣的含量（mg/kg或 mg /L）;T——EDTA 滴定度（mg/mL）;V1——滴定試樣溶液時所消耗的稀釋10倍的 EDTA 溶液的體積（mL）;V0——滴定空白溶液時所消耗的稀釋10倍的 EDTA 溶液的體積（mL）;V2——試樣消化液的定容體積（mL）;1 000——換算系數(shù);M——試樣質(zhì)量或移取體積（g或 mL）;V3——滴定用試樣待測液的體積（mL）。

1.2.5 酶解牛骨肽對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖作用 本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞實驗，探討酶解牛骨膠原肽對成骨細(xì)胞增殖作用的影響，研究膠原短肽的增加骨密度功能。取酶解牛骨膠原蛋白肽適量，用PBS緩沖液稀釋，使?jié)舛瘸蔀?、2、4 mg/mL的膠原蛋白肽溶液。MC3T3-E1細(xì)胞在含有10%胎牛血清和青鏈雙抗（100×，使用時100倍稀釋，使得青霉素終濃度為100 U/mL，鏈霉素終濃度為100 μg/mL）的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃，5%的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)5～6 d后做細(xì)胞傳代。吸去原培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗2～3次，然后加入0.5 mL 0.25%的含有1 mmol/L EDTA-4Na的胰蛋白酶，37 ℃消化30 s，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮情況，細(xì)胞變圓，不再貼壁，且成單一個體，不連接成片，加入10 mL DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮，將液體轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，1 000 r/min，離心5 min，吸去上清液，加入適量培養(yǎng)液，輕輕吹打，將細(xì)胞均勻的懸浮于液體培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，稀釋，計數(shù)，使得培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度為1×105/mL，然后將已知細(xì)胞濃度的培養(yǎng)液，加入96孔板中，加樣量為100 μL/孔，分為空白組（調(diào)零）、對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組等5個組，每組設(shè)定6個復(fù)孔。按照表2進(jìn)行加樣操作。實驗需要注意，MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，或是將MTT配制成0.5 g/L的溶液，小劑量分裝到EP管中，用避光袋或錫紙等可以遮光的材料包裹好，避免被光分解，-20 ℃長期保存，避免反復(fù)凍融。

1.3 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解牛骨肽對大鼠股骨重量的影響

與M組對比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠股骨重量的影響具有顯著性差異，低劑量組、中劑量組、高劑量組均有顯著性差異;與CON組（正常飼養(yǎng)對照組）相比，陽性藥組、中劑量組、高劑量組的受試藥物對大鼠股骨長度和股骨重量的影響具有顯著性差異（表3、圖2）。

2.2 酶解牛骨肽對大鼠股骨硬度的影響

由表4、圖3可知，與M組（低鈣模型組）對比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠左右股骨強(qiáng)度的影響均具有顯著性差異，低劑量組、中劑量組、高劑量組均有顯著性差異，空白組，即正常飼養(yǎng)組股骨強(qiáng)度有顯著差異，說明造模成功;與CON組（正常飼養(yǎng)對照組）相比，陽性藥組、中劑量組、高劑量組的受試藥物對大鼠左右股骨強(qiáng)度的影響具有顯著性差異。

2.3 酶解牛骨肽對大鼠骨骼含鈣量的影響

由表5、圖4可知，與M組（低鈣模型組）對比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠骨骼中鈣離子含量的影響具有顯著性差異，中劑量組、高劑量組也具有顯著性差異，低劑量組比低鈣模型組骨骼中鈣離子含量高，但是在P<0.05時不具有顯著性差異;與CON組（正常飼養(yǎng)對照組）相比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠骨骼中鈣離子含量的影響具有顯著性差異，高劑量組也具有顯著性差異，中劑量組無顯著性差異，但是鈣離子含量比CON組（正常飼養(yǎng)對照組）高，低劑量組與CON組（正常飼養(yǎng)對照組）相比沒有明顯差異。

2.4 酶解牛骨肽對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的影響

由表6、圖5可知，與對照組相比，P<0.05，中劑組量組和高劑量組的吸光度值有顯著性差異，對照組是在96孔板上正常培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過MTT反應(yīng)后測得的吸光度值，反映了經(jīng)過72 h生長后活細(xì)胞的數(shù)量，各個劑量組是在正常培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入低、中、高劑量的酶解多肽，經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)吸光度值比對照組有所增加，且中劑量組與高劑量組與對照組相比，其活細(xì)胞數(shù)具有顯著性差異（P<0.05）。正常情況下，細(xì)胞培育72 h后，在這一段時間內(nèi)，細(xì)胞會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，經(jīng)歷生長、增長、衰老、凋亡等一系列變化，整個體系中會存在凋亡的細(xì)胞，也有正在生長的活細(xì)胞，通過MTT法可以檢測到體系中活細(xì)胞的數(shù)量，以吸光度值（OD值）間接反映活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，說明活細(xì)胞數(shù)量越多，以上數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，中劑量組和高劑量組活細(xì)胞數(shù)更多，且存在統(tǒng)計學(xué)意義，說明中劑量和高劑量的酶解多肽對體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞的增殖活性具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。成骨細(xì)胞是形成骨組織的細(xì)胞，合成并分泌骨基質(zhì)，參與骨的鈣化，口服膠原蛋白水解物能提高骨骼的新陳代謝和骨密度，低分子量的膠原肽以肽的形式被吸收進(jìn)入血液，并能通過增加骨骼的有機(jī)物部分達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的效果[11-12]。

3 討論

以上動物實驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，酶解牛骨肽可以增加大鼠股骨強(qiáng)度，增加股骨中鈣離子含量，促進(jìn)大鼠鈣離子的吸收，促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖。實驗設(shè)立了模型組，空白組（正常飼養(yǎng)組），高、中、低劑量組，陽性藥組，長時間低鈣飲食可以造成Wistar大鼠暫時性的缺鈣，正常飲食的實驗大鼠體內(nèi)鈣離子含量與造成低鈣模型后給予低劑量酶解牛骨肽后體內(nèi)鈣水平相當(dāng)，說明當(dāng)大鼠缺鈣時，可以通過恢復(fù)正常飲食補(bǔ)鈣，也可以通過服用酶解多肽快速補(bǔ)鈣，高、中劑量組大鼠體內(nèi)骨鈣含量高于正常飼養(yǎng)組，酶解骨肽可以提高正常飲食大鼠骨鈣含量，說明大鼠需要額外攝入鈣離子，以滿足生長需要，給予中劑量和高劑量牛骨酶解肽組大鼠體內(nèi)鈣離子水平相差不大，但是說明高劑量的鈣離子不能被人體全部利用，當(dāng)鈣離子滿足人體正常生理需求之后，就不再增加，多余的鈣離子不沉積在骨骼上，而是被代謝排出體外，因為鈣的代謝受多種因素調(diào)節(jié)和影響，攝入的鈣只有一部分能被腸道吸收，多余的都隨糞便排出體外[13]。酶解牛骨肽可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨細(xì)胞的生長，對大鼠生長有促進(jìn)作用，動物骨鈣含量和骨強(qiáng)度都明顯增加，而且不低于碳酸鈣對照組，說明該藥物具有增加骨密度的功效。該酶解牛骨肽既可以增加骨密度，提高骨骼強(qiáng)度，又可以促進(jìn)骨細(xì)胞的快速生長，促進(jìn)骨的快速形成。1986年Harvey提出了新的鈣吸收理論，認(rèn)為鈣先是與腸道內(nèi)的氨基酸或者短鏈多肽結(jié)合，然后再以整體的分子狀態(tài)被吸收，已有大量試驗證明，多肽可以與金屬離子結(jié)合進(jìn)入粘膜細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體對礦質(zhì)元素的吸收，推測在大鼠的消化腸道內(nèi)，酶解牛骨肽也可以與鈣離子發(fā)生結(jié)合形成可溶性復(fù)合物，避免鈣離子的沉淀，保證鈣離子能順利到達(dá)鈣吸收位點被大鼠吸收[14-16]，從而提高骨鈣含量。酶解牛骨肽可以促進(jìn)成骨細(xì)胞快速生長，推測其對骨細(xì)胞表現(xiàn)出類生長因子作用。酶解牛骨肽促進(jìn)骨骼生長及增加骨骼強(qiáng)度等作用機(jī)理仍需做進(jìn)一步驗證和研究。◇

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Abstract：Using low-calcium rat food to feed Wistar rats，the low-calcium model was created，and the rats in the oral model group were given enzymolysis of bovine bone peptide for 3 months.The effects of enzymolysis of bovine bone peptide on bone growth in low-calcium rats were studied.The body mass index and weight of the femur of rats in each experimental group were determined.A number of physiological and biochemical indicators such as femur strength，bone calcium content，and serum calcium ion content were also performed in vitro cell experiments to study the effect of enzymatic hydrolysis of bovine bone peptide on the proliferation of osteoblasts MC3T3-E1.The results showed that the enzymatic hydrolysis of bovine osteopeptide had significant effect on the increase of bone calcium in low calcium rats（P<0.05），enzymatic hydrolysis of bovine bone peptide can promote the growth of osteoblasts MC3T3-E1 in vitro，indicating that enzymatic hydrolysis of bovine bone peptide can promote bone growth and development to a certain extent.

Keywords：enzymatic hydrolysis of bovine bone;peptides;low calcium model;osteoblasts