離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化特性的影響

祝超智 李珊珊 崔文明 趙改名 李佳麒 銀峰 焦陽陽 唐穎達(dá)

摘 要：為研究離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化特性的影響，測定煮制前后不同NaCl濃度（0.0、0.2、0.4、0.6 mol/L）豬肉可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白的乳化特性，包括乳化活性指數(shù)（emulsification activity index，EAI）、

乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）、黏度及乳化液微觀結(jié)構(gòu)，同時測定豬肉膠原蛋白溶解度。結(jié)果表明：隨著介質(zhì)離子強(qiáng)度的提高，豬肉可溶性膠原蛋白溶解度降低，黏度增大，EAI先升高后降低，ESI先降低后升高;豬肉不溶性膠原蛋白溶解度升高，黏度增大，EAI、ESI均呈先升高后降低趨勢。改變膠原蛋白的離子強(qiáng)度或?qū)δz原蛋白進(jìn)行熱處理，均能使豬肉可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白的乳化特性發(fā)生顯著變化。

關(guān)鍵詞：離子強(qiáng)度;豬肉膠原蛋白;乳化特性;溶解度

Effect of Ionic Strength on the Emulsification Characteristics of Pork Collagen before and after Cooking

ZHU Chaozhi， LI Shanshan， CUI Wenming， ZHAO Gaiming*， LI Jiaqi， YIN Feng， JIAO Yangyang， TANG Yingda

（College of Food Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： In order to explore the effect of ionic strength on the emulsification characteristics of pork collagen before and after cooking， this study evaluated the emulsification properties of soluble and insoluble pork collagen in the presence of different concentrations of NaCl （0.0， 0.2， 0.4 and 0.6 mol/L）， including emulsification activity index （EAI）， emulsion stability index （ESI）， viscosity， emulsion microstructure， and solubility. The results showed that with increasing ionic strength， the solubility of soluble collagen decreased， the viscosity increased， EAI first increased and then decreased， while ESI exhibited the opposite trend; the solubility and viscosity of insoluble collagen increased， and both EAI and ESI showed a trend of first increase and then decrease. In conclusion， the change in ionic strength or heat treatment could significantly change the emulsification characteristics of both soluble and insoluble pork collagen.

Keywords： ionic strength; pork collagen; emulsification characteristics; solubility

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191206-300

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）06-0008-06

引文格式：

祝超智， 李珊珊， 崔文明， 等. 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化特性的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（6）： 8-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191206-300.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHU Chaozhi， LI Shanshan， CUI Wenming， et al. Effect of ionic strength on the emulsification characteristics of pork collagen before and after cooking[J]. Meat Research， 2020， 34（6）： 8-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191206-300.

http：//www.rlyj.net.cn

膠原蛋白是一種三螺旋纖維狀蛋白質(zhì)[1]，存在于動物的皮膚、血管、骨骼、肌腱、韌帶等部位，在哺乳動物體內(nèi)分布廣且含量多，與各個組織和器官功能相關(guān)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%[2]，與細(xì)胞間信息傳遞、組織形成和成熟、細(xì)胞增生和分化、細(xì)胞免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移及傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等有緊密

聯(lián)系[3]。膠原蛋白具有良好的生物相容性[4]、可降解性、低過敏性及生物活性，在食品加工[5-7]、醫(yī)藥保健[2，8]和化妝品[9-10]等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。

劉晶晶等[11]研究表明，膠原蛋白對乳化肉制品的嫩度、質(zhì)構(gòu)、剪切力和出品率有直接影響。王碧等[12]研究水解膠原蛋白的乳化性能，結(jié)果表明，隨著膠原蛋白溶液質(zhì)量濃度的增加，膠原蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)，在酸性、堿性溶液中表現(xiàn)出較高的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，同時，一定濃度的電解質(zhì)也可以提高膠原蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

食鹽是肉類加工不可缺少的輔料，能有效提高離子強(qiáng)度。添加一定量的食鹽可以提高肉制品的乳化

能力[13-14]。食鹽可以直接影響膠原蛋白的理化和加工特性，但過高用量會影響人體健康，過低用量可能會影響蛋白的加工特性，導(dǎo)致肉制品品質(zhì)變化[15-16]。蛋白質(zhì)分子間的相互作用力對乳化性也有明顯影響[17]。膠原蛋白溶液黏度受到多種因素的影響，隨著外加電解質(zhì)的改變而改變;在偏離膠原蛋白等電點(diǎn)時，由于外在離子的影響，膠原蛋白溶液黏度也會發(fā)生變化[18]。目前關(guān)于NaCl對肌肉蛋白質(zhì)加工特性影響的研究較多，但對可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白乳化特性影響的研究較少。

本研究以冷鮮豬肉為原料，提取并分離可溶性與不溶性膠原蛋白，以煮制前后膠原蛋白為乳化劑，大豆油為油相，模擬肉湯構(gòu)建乳化體系，用NaCl改變介質(zhì)的離子強(qiáng)度，研究離子強(qiáng)度對冷鮮豬肉膠原蛋白乳化特性（包括乳化活性指數(shù)（emulsification activity index，EAI）、

乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）、乳化液黏度）的影響以及離子強(qiáng)度和煮制處理造成膠原蛋白乳化性質(zhì)差異的原因，以期優(yōu)化乳化型肉制品的生產(chǎn)配方，降低NaCl用量，為低鹽乳化型肉制品的加工生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊（帶皮）（長白豬，胴體質(zhì)量120 kg，平均日齡180 d，宰后pH24 h 5.8±0.1）購于雙匯豐產(chǎn)路店，于-18 ℃冰箱貯藏備用，使用前在4 ℃冰箱解凍24 h;非轉(zhuǎn)基因大豆油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司。

碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、六水氯化鈣 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯胺T 天津大茂化學(xué)試劑有限公司;對二甲氨基苯甲醛 上海易恩試劑有限公司;十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索萊寶生物科技有限公司;異丙醇?天津市富宇精細(xì)化工有限公司;正丙醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司;

DZKW-C恒溫水浴鍋 上海樹立儀器有限公司;AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;NDJ系列黏度計 上海精天電子儀器有限公司;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司;Eclipse 80i科研級顯微鏡 日本尼康儀器有限公司;T10 Ultra-Turrax高速分散器 德國IKA公司;BPG-9156A精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉膠原蛋白的提取

1.3.1.1 肉樣加熱預(yù)處理

在4 ℃條件下將肉樣解凍24 h，剔除表面脂肪和肌膜，切成1.0 cm×1.0 cm×2.0 cm肉塊，用蒸煮袋包裝，在水浴鍋中沸水（100 ℃）加熱90 min，流水冷卻至室溫，立即取出，用吸水紙吸干肉塊表面水分，待用。

1.3.1.2 可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白的分離

采用Ringers試劑溶解法[1]。配制Ringers試劑（1.8 g NaCl、0.25 g KCl、0.06 g CaCl2·6H2O、0.05 g NaHCO3、0.186 g碘乙酸，溶于1 L蒸餾水），精確稱量預(yù)處理后樣品5 g，加入8 mL Ringers試劑，用高速分散器將肉樣打碎，混勻溶脹1 h后在77 ℃水浴中加熱1 h;冷卻至室溫，3 300×g離心20 min，收集上清液，重復(fù)2 次。所得上清液即為可溶性膠原蛋白，沉淀為不溶性膠原蛋白。

1.3.2 豬肉膠原蛋白含量測定

參考GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》測定羥脯氨酸含量，按照式（1）～（2）分別計算豬肉中不溶性膠原蛋白和可溶性膠原蛋白含量。

（1）

（2）

1.3.3 不同NaCl濃度豬肉膠原蛋白溶液的制備

參考吳菊清等[19]的方法，稱取一定量膠原蛋白（可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白）溶于NaCl濃度為0.0、0.2、0.4、0.6 mol/L的磷酸鹽緩沖液

（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.5）中，配制不同NaCl濃度的膠原蛋白溶液（NaCl濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6 mol/L），使最終溶液中可溶性膠原蛋白質(zhì)量濃度均為34 ?g/mL，不溶性膠原蛋白質(zhì)量濃度均為

25 ?g/mL。1 組于4 ℃左右保存待用;另1 組于100 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，待用;分別作為煮制前后膠原蛋白溶液。

1.3.4 豬肉膠原蛋白溶解度測定

采用雙縮脲法[20]并稍作修改。分別取7 mL煮制前后不同NaCl濃度的可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白溶液，1 500×g離心10 min，取上清液及離心前不同NaCl濃度的膠原蛋白溶液各2 mL，分別加入8 mL雙縮脲試劑混勻，同時取不同NaCl濃度的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L

Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.5）2 mL與8 mL雙縮脲試劑混勻后作為空白對照，置于20～25 ℃保溫30 min，用紫外分光光度計于540 nm波長處測定吸光度，每個處理重復(fù)測定3 次。以膠原蛋白溶液中羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.189 2x+

0.046 0（R2=0.999 1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及羥脯氨酸與膠原蛋白含量換算關(guān)系得出膠原蛋白質(zhì)量濃度。膠原蛋白溶解度按式（3）計算。

（3）

式中：ρ2為離心后上清液中膠原蛋白質(zhì)量濃度/（?g/mL）;ρ1為離心前溶液中膠原蛋白質(zhì)量濃度/（?g/mL）。

1.3.5 豬肉膠原蛋白乳化液的制備

參考郝月慧[21]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。分別取煮制前后4 mL 34 ?g/mL不同NaCl濃度可溶膠原蛋白溶液和25 ?g/mL不溶膠原蛋白溶液于10 mL離心管中，加入1 mL大豆油，用高速分散器進(jìn)行勻漿，14 000 r/min勻漿20 s，暫停10 s，共勻漿1 min，得到不同NaCl濃度的膠原蛋白乳化液。

1.3.6 豬肉膠原蛋白乳化液EAI及ESI測定

參考Ramírez-Suárez等[22]的方法，并稍作修改。取煮制前后不同NaCl濃度的可溶性膠原蛋白和不溶性膠原蛋白乳化液，分別于制備后0 min和靜置10 min時于乳液底部迅速移取30 μL，用0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋500 倍，以0.1 g/100 mL SDS溶液作為空白，立即于500 nm波長處測定吸光度，按式（4）～（5）計算乳化液EAI及ESI。

式中：ρ為乳化前膠原蛋白溶液質(zhì)量濃度/（g/mL）;

φ為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)/%;A0為0 min時膠原蛋白乳化液吸光度;500為稀釋倍數(shù);A10為靜置10 min時膠原蛋白乳化液吸光度;10為間隔時間/min。

1.3.7 豬肉膠原蛋白乳化液黏度測定

采用數(shù)顯式黏度計，選擇1號轉(zhuǎn)子在60 r/min轉(zhuǎn)速下迅速測定新制豬肉膠原蛋白乳化液黏度，每個處理組平行測定3 次。

1.3.8 豬肉膠原蛋白乳化液微觀結(jié)構(gòu)觀察

迅速從離心管底部取適量新制乳化液，在載玻片上涂抹均勻，在4 ℃條件下冷卻1 d，在相差顯微鏡下觀察拍照，放大倍數(shù)400。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)間顯著性分析采用多因素方差分析和Duncans多重比較法，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白溶解度的影響

小寫字母不同，表示同一樣品、不同離子強(qiáng)度間差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示同種膠原蛋白溶液煮制前后差異顯著（P<0.05）。圖2同。

由圖1可知，隨著介質(zhì)離子強(qiáng)度的提高，不溶性膠原蛋白溶解度逐漸增加，NaCl濃度為0.6 mol/L時達(dá)到最大?？扇苄阅z原蛋白溶解度的變化趨勢與不溶性膠原蛋白相反，隨著離子強(qiáng)度的增加逐漸下降，NaCl濃度為0.6 mol/L時，溶解度達(dá)到最小。這可能是由于膠原蛋白產(chǎn)生鹽析[23]，使其溶解度降低，NaCl濃度為0.6 mol/L時的鹽析程度最大。100 ℃煮制處理對可溶性膠原蛋白與不溶性膠原蛋白溶解度的影響不同，煮制30 min可以顯著提高不溶性膠原蛋白溶解度（P<0.05），但對于可溶性膠原蛋白，其溶解度相對于未經(jīng)煮制的處理組顯著降低（P<0.05）。這可能是由于加熱使膠原蛋白變性，從而影響其溶解度，另外，煮制時溶解的豬肉膠原蛋白會隨著蒸煮損失流失，也會導(dǎo)致溶解度降低[24]。

2.2 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化特性的影響

2.2.1 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化活性的影響

乳化活性是蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與脂肪之間的相互作用[25-26]，乳化活性增加有助于乳化物的形成[27]。由圖2可知，NaCl濃度（0.0～0.2 mol/L）較低時，隨著離子強(qiáng)度增加，煮制前后豬肉可溶性膠原蛋白EAI均呈現(xiàn)上升趨勢，NaCl濃度為0.2 mol/L時達(dá)到最大，之后隨著離子濃度增加，NaCl濃度0.4、0.6 mol/L可溶性膠原蛋白的EAI均顯著下降（P<0.05）。不溶性膠原蛋白EAI的變化趨勢與可溶性膠原蛋白相同，隨著離子強(qiáng)度增加，EAI先升高后下降，NaCl濃度為0.2 mol/L時達(dá)到最大。這是由于NaCl的加入可能起到兩方面作用[18，28-29]：一方面，離子強(qiáng)度增加會降低膠原蛋白分子間斥力，有利于膠原蛋白溶解，膠原蛋白充分發(fā)揮表面活性劑的作用，使油滴更容易與其結(jié)合，從而提高乳化性;另一方面，隨著離子強(qiáng)度增加，鹽離子會對擴(kuò)散的雙電層厚度進(jìn)行壓縮，導(dǎo)致乳化液液滴表面電位降低，乳化液體系斥力能壘下降，因此液滴間易產(chǎn)生聚集，引起乳化活性降低。離子強(qiáng)度較低時，前者起主要作用，隨著離子強(qiáng)度增加，后一種作用更明顯，膠原蛋白乳化活性隨著NaCl濃度的增加而降低[30-31]。因此，一定范圍內(nèi)離子強(qiáng)度的增加有利于減少膠原蛋白間的排斥力，提高其EAI，但當(dāng)離子強(qiáng)度超過一定范圍，膠原蛋白出現(xiàn)凝聚，使其EAI降低。煮制后豬肉膠原蛋白EAI較煮制前顯著降低（P<0.05），這可能是由于加熱使表面電荷減少，導(dǎo)致乳化液體系斥力下降，液滴間易產(chǎn)生聚集，從而引起乳化性下降[32]。

2.2.2 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化穩(wěn)定性的影響

由表1可知，隨著NaCl濃度的增加，豬肉膠原蛋白ESI的變化趨勢較為復(fù)雜，煮制前后可溶性膠原蛋白ESI均為先降低后升高再下降，NaCl濃度0.4 mol/L組顯著高于0.0、0.2 mol/L組（P<0.05），0.6 mol/L組較0.4 mol/L組有下降趨勢，但煮制后豬肉可溶性膠原蛋白ESI下降趨勢不明顯。可溶性膠原蛋白的ESI與EAI具有相反的變化趨勢，即在EAI較低的離子強(qiáng)度條件下，ESI較高，NaCl濃度為0.2 mol/L時，豬肉可溶性膠原蛋白EAI達(dá)到最大，但此時ESI最低。這與高金龍[18]的研究一致。隨著NaCl濃度上升，豬肉不溶性膠原蛋白ESI先升高后降低，NaCl濃度為0.2 mol/L時ESI最高;NaCl濃度（0.0～0.2 mol/L）較低時ESI較高，隨著離子強(qiáng)度增加，ESI顯著下降（P<0.05），0.4、0.6 mol/L組間差異顯著（P<0.05）。煮制后豬肉膠原蛋白ESI較煮制前顯著提高（P<0.05），這可能是由于加熱加速了蛋白質(zhì)巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，增大了蛋白質(zhì)空間位阻，從而提高了乳化液穩(wěn)定性[33]。

2.2.3 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白黏度的影響

由表2可知，隨著NaCl濃度增加，煮制前后豬肉可溶性膠原蛋白黏度均逐漸增大，NaCl濃度達(dá)到0.6 mol/L時，可溶性膠原蛋白黏度達(dá)到最大，且顯著高于其他實(shí)驗組（P<0.05）。隨著NaCl濃度增加，不溶性膠原蛋白黏度逐漸增加，各實(shí)驗組間均有顯著差異（P<0.05），0.6 mol/L組顯著高于其他實(shí)驗組（P<0.05）。豬肉膠原蛋白經(jīng)過煮制后，黏度顯著增大（P<0.05）。這是由于膠原蛋白是典型的兩性聚電解質(zhì)，NaCl的加入產(chǎn)生以下幾方面作用：1）增強(qiáng)溶劑極性，從而增強(qiáng)膠原蛋白及多肽疏水締合作用，容易形成具有大流體力學(xué)體積的聚集體，離子強(qiáng)度越大，這種作用越大，黏度越大;2）屏蔽膠原蛋白及多肽分子內(nèi)正負(fù)基團(tuán)的相互作用，使鹽鍵受到破壞，分子鏈伸展，黏度升高;3）離子強(qiáng)度越大，對聚合物側(cè)基電荷的屏蔽作用越強(qiáng)，更容易引起鏈蜷曲，造成黏度下降;但由于前兩方面的作用對黏度的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于后者，因此鹽的加入導(dǎo)致黏度明顯上升[34-35]。

2.3 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉膠原蛋白乳化液微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉可溶性膠原蛋白乳化液微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，離子強(qiáng)度較低時（NaCl濃度0.0～0.2 mol/L），豬肉可溶性膠原蛋白乳化液粒徑隨著NaCl濃度的增加逐漸變小，粒徑較大的乳化液液滴數(shù)量也逐漸變少，NaCl濃度0.2 mol/L時的乳化液粒徑最小，大微粒數(shù)量最少，分布較均勻。隨著離子強(qiáng)度繼續(xù)增加，乳化液微粒直徑逐漸增大，大微粒數(shù)量增多。豬肉可溶性膠原蛋白經(jīng)過煮制，乳化液微粒粒徑同樣隨著離子強(qiáng)度的增加先變小后增大。煮制前膠原蛋白乳化液微粒分布較煮制后更加密集、均勻。

A～D. NaCl濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6 mol/L;

下標(biāo)1、2. 分別表示煮制前、煮制后。圖4同。

2.3.2 離子強(qiáng)度對煮制前后豬肉不溶性膠原蛋白乳化液微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可知，豬肉不溶性膠原蛋白乳化液微粒呈條狀，離子強(qiáng)度（NaCl濃度0.0～0.2 mol/L）較低時，隨著NaCl濃度的增加，不溶性膠原蛋白乳化液微粒粒徑逐漸減小，分布均勻。NaCl濃度為0.2 mol/L時的乳化液微粒分布最均勻。隨著離子強(qiáng)度繼續(xù)增加，乳化液顆粒分布逐漸稀疏。煮制前不溶性膠原蛋白乳化液微粒分布較煮制后更加密集、均勻。

3 結(jié) 論

以豬肉膠原蛋白為乳化劑，大豆油為油相，模擬構(gòu)建煮制肉湯乳化體系，測定不同離子強(qiáng)度條件下豬肉可溶性膠原蛋白與不溶性膠原蛋白的乳化特性。結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，NaCl濃度的增加有利于提高豬肉膠原蛋白乳化性;NaCl濃度為0.2 mol/L時，豬肉膠原蛋白EAI達(dá)到最大，隨著NaCl濃度繼續(xù)增加，豬肉膠原蛋白EAI逐漸降低;豬肉膠原蛋白ESI的變化較為復(fù)雜，可溶性膠原蛋白的ESI變化趨勢與EAI相反，即在EAI較高的離子強(qiáng)度時ESI較小，不溶性膠原蛋白的ESI與EAI具有相同的變化趨勢;同時，隨著離子強(qiáng)度的提高，豬肉可溶性膠原蛋白溶解性降低，黏度顯著提高。經(jīng)煮制處理后，可溶性膠原蛋白溶解度和EAI降低，ESI和黏度增加;不溶性膠原蛋白EAI降低，蛋白溶解度、ESI和黏度均增大。

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