ANA及ANAs在原發(fā)性血小板減少癥患者診斷中的應(yīng)用

何棟，黎楊楊，陳冬玲

(陽江市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 陽江 529500)

對人體來說，當(dāng)出現(xiàn)不明原因?qū)е碌难“逅降陀谡Ｖ禃r(shí)，就會造成人體出現(xiàn)出血傾向[1]?；颊咧髟V皮膚粘膜出血、消化道出血等癥狀入院就診，臨床醫(yī)生通過對患者進(jìn)行一系列檢查后，可診斷出患者患有血小板減少癥，但因?yàn)檎也坏交颊哐“鍦p少病因，將患者病癥歸為原發(fā)性血小板減少癥[2]。由于原發(fā)性血小板減少癥造成嚴(yán)重出血情況會使人體受到極大的危害，所以對于原發(fā)性血小板減少癥，要高度重視并積極選用科學(xué)的治療方法和預(yù)后措施[3～4]。因此針對于該病檢測顯得尤為重要，目前針對原發(fā)性血小板減少癥患者檢測手段眾多，對于該病患者進(jìn)行ANA及ANAs檢測研究相對較少。本文主要探討抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)及抗核抗體譜(antinuclear antibody spectrum，ANAs)在原發(fā)性血小板減少癥患者診斷中的應(yīng)用研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在2016年1月至2020年3月期間我院收治的114例初步診斷為原發(fā)性血小板減少癥的患者作為研究對象。年齡范圍3～91歲，平均(51±6.86)歲，男性40例，女性74例?；颊咴谝话阗Y料上幾乎無差異。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷與原發(fā)性血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合[5-6]；(2)無惡性腫瘤、其他內(nèi)分泌疾病等合并疾病情況；(3)向患者及家屬講解此次研究，獲得患者與家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者存在嚴(yán)重精神病史或表達(dá)功能嚴(yán)重喪失；(2)具有嚴(yán)重的心肝肺臟器疾病者。

1.2 方法

患者檢測前需要禁食12 h后采集空腹外周靜脈血5 mL。采血完成后要及時(shí)對標(biāo)本標(biāo)記，并以3000 r/min離心10 min，分離血清后冷凍保持待測，間接免疫熒光方法檢測ANA陽性率，歐盟印跡法測定ANAs陽性率，包括測定ANAs中的抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP、抗核糖體P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1陽性率。步驟如下：

ANA檢測：(1)試劑盒開封后，置于室溫下進(jìn)行20～30 min平衡；(2)1∶100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻；(3)在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板；(4)將載片蓋在加樣板對應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個(gè)標(biāo)本均能夠與生物薄片相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫(18 ℃～25 ℃)溫育30 min；(5)將20 μL熒光標(biāo)記的抗人球蛋白加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育。從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載5 s內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意避免陽光直射載片。室溫(18 ℃～25 ℃)溫育30 min。用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5 min?？稍诿?50 mL磷酸鹽緩沖液中加10滴伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染；(6) 結(jié)果評估，熒光顯微鏡下觀察熒光。若細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性?？乖谐霈F(xiàn)陽性染色細(xì)胞為ANA陽性，否則為陰性。(待測血清按照1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200這4個(gè)滴度進(jìn)行測試)

ANAs檢測：(1)預(yù)處理：取出所需的膜條，將其放入溫有槽內(nèi)。膜條上有編號的一面朝上，所有樣本均進(jìn)行稀釋處理。加1.5 mL的樣本緩沖液于溫育槽中，置于室溫下(18 ℃～25 ℃)搖擺搖床上進(jìn)行5 min溫育，除去剩余液體；(2)血清進(jìn)行溫育：加1.5 mL血清樣本于溫育槽，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進(jìn)行30 min溫育；(3)溫育槽清選：除去槽內(nèi)多余液體，加1.5 mL清洗緩沖液于溫育槽中，置于室溫下(18 ℃～25 ℃)搖擺搖床上進(jìn)行5 min膜條清洗，分3次進(jìn)行；(4)酶結(jié)合物育：加1.5 mL酶結(jié)合物樣本于溫有槽中，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進(jìn)行30 min溫育；(5)溫育槽清選：除去槽內(nèi)多余液體，加1.5 mL清洗緩沖液于溫育槽中，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進(jìn)行5 min膜條清洗，分3次進(jìn)行；(6)底物溫有：加1.5 mL底物液于溫有槽中，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進(jìn)行10 min溫育；(7)終止：除去槽內(nèi)多余液體，加蒸餾水于溫育槽中，置于室溫下(18 ℃～25 ℃)搖擺搖床上進(jìn)行1 min膜條清洗，分3次進(jìn)行；(8)結(jié)果評估：在進(jìn)行結(jié)果判定的模板中放置檢測膜條，風(fēng)干后進(jìn)行評估判定。檢測質(zhì)量控制程序：在檢測膜條的質(zhì)控帶處，若質(zhì)控帶相應(yīng)抗原位置發(fā)生顯色反應(yīng)，則操作正確(待測血清按照1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200這4個(gè)滴度進(jìn)行測試)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ANA及ANAs測定結(jié)果比較

所有患者進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，ANAs陽性率44%明顯高于ANA陽性率37%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 ANA及ANAs測定結(jié)果比較

2.2 ANA及ANAs測定結(jié)局比較

所有患者進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行ANAs檢測，患者的確診率為88%，明顯高于進(jìn)行ANA檢測患者的確診率16%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 ANA及ANAs測定結(jié)局比較

2.3 ANAs呈現(xiàn)陽性患者相關(guān)抗體陽性率比較

在ANAs中的抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP/SM、抗核糖體P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1中，抗SSA陽性率表達(dá)，見表3。

表3 ANAs呈現(xiàn)陽性患者相關(guān)抗體陽性率比較

3 討 論

血小板減少癥是指負(fù)責(zé)人體凝血功能，存在于外周血中的血小板水平低于人體正常值，導(dǎo)致人體出現(xiàn)出血傾向或凝血障礙，發(fā)生自發(fā)性出血癥狀[7-8]。癥狀輕微的患者，基本不會對生活造成影響，但病情較重的患者會出現(xiàn)皮膚粘膜出血、牙齦出血、女性月經(jīng)期間出血量增多，甚至有的患者會出現(xiàn)腦出血，內(nèi)臟自發(fā)性出血等危及生命的癥狀，因此一旦發(fā)生血小板減少癥，要高度重視并科學(xué)的進(jìn)行治療和預(yù)后[9-11]。臨床上將血小板減少癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，繼發(fā)性血小板減少癥是在人體出現(xiàn)器臟疾病、自身免疫疾病、感染、腫瘤等疾病時(shí)的并發(fā)癥狀，經(jīng)過完善醫(yī)療檢查就可找到病因，對癥下藥治療后，患者血小板減少得以緩解[12]。但原發(fā)性血小板減少癥在排除上述癥狀后通常無法找到病因，該病發(fā)病機(jī)制與遺傳、免疫系統(tǒng)紊亂等復(fù)雜因素有關(guān)[13]。由于該病具有病程長，可反復(fù)等難以控制的因素，需要患者長期進(jìn)行專業(yè)的治療和隨訪，對患者生活和健康造成嚴(yán)重影響。

為了及時(shí)掌握原發(fā)性血小板減少癥患者健康情況，對該病患者開展有效治療和預(yù)后措施，近年來，臨床對原發(fā)性血小板減少癥診斷開辟了多種檢測方式。ANA是對細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)等分子復(fù)合物產(chǎn)生的自身抗體，存在于IgG中，由于其具有能識別各種細(xì)胞核組分，能特征性地出現(xiàn)于許多自身免疫性疾病中，當(dāng)ANA呈現(xiàn)陽性時(shí)，可判斷如原發(fā)性血小板減少癥及相關(guān)自身免疫疾病的活動性及預(yù)后，觀察治療反應(yīng)，指導(dǎo)臨床治療。ANAs是抗核抗體的一種總稱，它主要包括3種不同的抗體：DNA、組蛋白以及非組蛋白。主要就是種屬不同。ANAs的檢測，其陽性表達(dá)不僅能診斷一些結(jié)締組織病，還能有針對性檢測出特異性抗體。抗ssa、ssb、Ro-52抗體是干燥綜合癥的一種抗體[14-18]?？笿o-1抗體是皮肌炎的標(biāo)記性抗體[19]。抗scl-70抗體是系統(tǒng)性硬化的標(biāo)記性抗體等。在本次研究中，所有患者通過間接免疫熒光方法對ANA進(jìn)行檢測，歐盟印記法對ANAs進(jìn)行檢測，對比分析發(fā)現(xiàn)，ANAs陽性率44%明顯高于ANA陽性率37%，說明ANAs特異性更高。對所有患者最終確診為原發(fā)性血小板減小癥患者確診率進(jìn)行比較ANAs確診率88%明顯高于ANA確診率16%，同時(shí)ANAs呈陽性患者中抗抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP/SM、抗核糖體P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1中等8種抗體，其中抗SSA陽性率為80%，說明ANAs譜中抗SSA分布最廣，原發(fā)性血小板減少癥中沒有表達(dá)的抗體有抗Scl-70、抗Jo-1。通過統(tǒng)計(jì)對比還發(fā)現(xiàn)ANAs抗體中聯(lián)合表達(dá)陽性率為36%明顯高于單項(xiàng)表達(dá)陽性率17%，說明各抗體間存在一定關(guān)聯(lián)。

在原發(fā)性血小板減少癥臨床診斷體會：在臨床診斷原發(fā)性血小板減少癥過程中，由于該病病因復(fù)雜，在對患者進(jìn)行完善醫(yī)學(xué)檢查，排除其他疾病病因后，需要進(jìn)行自身抗體檢查，而在進(jìn)行ANA及ANAs檢測時(shí)，單一檢測ANAs患者最終確診率顯然比進(jìn)行ANA檢測高，但當(dāng)聯(lián)合進(jìn)行ANA及ANAs檢測時(shí)，患者確診率比任何單一檢查確診率更高。因此，對于原發(fā)性血小板減少癥患者進(jìn)行ANA及ANAs聯(lián)合檢測，能減少漏診率。

綜上所述，對原發(fā)性血小板減少癥患者進(jìn)行ANA及ANAs檢測，能提高陽性檢出率，保障患者檢測效果有效，對臨床診治具有實(shí)用有效價(jià)值。