雙信號金納米簇對三硝基甲苯的熒光分析*

胡婭琪，秦 蓓，關 麗，賀茂芳，張育珍

(西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021)

硝基化合物在工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛，是合成炸藥、殺蟲劑、除草劑及燃料等產(chǎn)品的重要化工原料。由于社會各個方面對其廣泛的需求，且該類化合物及其在環(huán)境中轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物大多數(shù)是危險有毒的化學品；另外，硝基芳香化合物本身在環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性、持久性和有毒性等特點[1]，因此對環(huán)境產(chǎn)生了嚴重的危害，造成了不可逆轉(zhuǎn)的環(huán)境污染問題。由于硝基芳香化合物在哺乳動物體內(nèi)易被轉(zhuǎn)化為致癌性更強的亞硝基和羥氨基化合物，對人類本身的生活健康更是產(chǎn)生極大的威脅[2]。其中三硝基甲苯(TNT)作為硝基芳香化合物的代表物，更是對環(huán)境、健康具有較大的危害性。因此， TNT的檢測是一個緊迫的科學問題[3]。

目前，在眾多TNT的檢測方法中，熒光分析法由于具有較高的靈敏度而受到廣泛的應用，其中大多數(shù)是以有機染料分子、量子點為傳感單元[4-7]。由于有機染料分子易發(fā)生光漂白現(xiàn)象導致穩(wěn)定性較差，量子點的前驅(qū)體具有毒性，因此很有必要發(fā)展一種熒光性能穩(wěn)定的探針用于TNT的分析檢測。熒光金納米簇和傳統(tǒng)的有機染料分子、量子點相比，具有環(huán)境友好、熒光性質(zhì)可調(diào)及表面易于修飾的優(yōu)點。目前TNT的熒光傳感器多為單信號探針，其容易受到環(huán)境影響而導致熒光信號受到干擾，而相對于單信號的輸出，雙信號的熒光傳感器則克服了這個缺點。作者利用牛血清白蛋白還原法制備金納米簇熒光探針，進一步將2-氨基嘌呤修飾到金納米簇(Au NCs)表面合成熒光性能穩(wěn)定的雙信號熒光探針，并將該熒光探針應用于TNT的高靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(BSA)：北京索萊寶生物科技有限公司；三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)：上海韶遠科技有限公司；2-氨基嘌呤(2-AP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝基苯(NB)、對硝基甲苯(DNT)、三硝基甲苯(TNT)、乙醇、丙酮：國藥集團化學試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。

熒光光譜儀：Cary Eclipse，紫外分光光度計：Cary 60，美國安捷倫科技有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀：EQUINOX-55，德國布魯克公司；透射電鏡：JEM 2100F，日本電子株式會社。

1.2 BSA-Au NCs、2-AP/BSA-Au NCs的制備

BSA修飾的Au NCs(BSA-Au NCs)根據(jù)文獻報道合成[8]，將5 mL 10 mmol/L的HAuCl4溶液(37 ℃)加入到5 mL 50 mg/mL BSA溶液(37 ℃)中，混合后在50 mL圓底燒瓶中37 ℃水浴攪拌5 min，再加入0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，繼續(xù)攪拌12 h，反應結束后得到的棕色溶液即為BSA-Au NCs，將其透析過夜，純化后得到的BSA、Au NCs儲存于4 ℃冰箱中備用。

2-氨基嘌呤修飾的Au NCs(2-AP/BSA-Au NCs)通過EDC/NHS交聯(lián)反應制得，將5 mL 10 mmol/L的2-AP溶液加入到5 mL純化備用的BSA-Au NCs溶液中，加入60 mmol/L EDC、NHS溶液，在50 mL圓底燒瓶中混合水浴中持續(xù)攪拌5 h，反應結束后得到的棕色溶液即為2-AP-BSA-Au NCs，將其透析過夜除去多余未反應的2-AP分子，純化后得到的2-AP/BSA-Au NCs儲存于4 ℃冰箱中備用。

2 結果與討論

2.1 金納米簇的表征

以BSA作為保護劑和還原劑合成了BSA-Au NCs，插圖為自然光和紫外光條件下BSA-Au NCs圖片,對其進行熒光光譜測試得到其激發(fā)(EX)和發(fā)射(EM)曲線，見圖1。

λ/nm圖1 BSA-Au NCs的熒光光譜圖

由圖1可知，BSA-Au NCs的最大激發(fā)波長為500 nm，最大發(fā)射波長為673 nm，發(fā)射紅光，具有較大的斯托克斯位移(173 nm)。

BSA-Au NCs的透射電鏡圖見圖2。

圖2 BSA-Au NCs的透射電鏡圖

由圖2可知，BSA-Au NCs平均尺寸為1.5 nm，具有良好的分散性。

將2-AP修飾在BSA-Au NCs表面后，通過熒光光譜測試研究了2-AP/BSA-Au NCs、BSA-Au NCs和2-AP發(fā)射光譜曲線的變化，見圖3。

λ/nm圖3 樣品的熒光光譜圖

由圖3可知，2-AP的熒光發(fā)射峰在370 nm，BSA-Au NCs熒光發(fā)射峰位于673 nm，2-AP/BSA-Au NCs的熒光發(fā)射峰位于384 nm和643 nm。相對于前兩者其熒光發(fā)射峰均有所移動，可能是由于2-AP的引入改變了BSA-Au NCs的配體，使其金核的電子轉(zhuǎn)移有所改變，因此發(fā)光性質(zhì)有所改變。

分別對BSA-Au NCs、2-AP、2-AP/BSA-Au NCs測定紅外吸收光譜，見圖4。

σ/cm-1圖4 樣品的傅立葉變換紅外光譜圖

2.2 條件優(yōu)化

Au NCs和2-AP的濃度均會影響2-AP/BSA-Au NCs的熒光強弱，若2-AP濃度較低，BSA-Au NCs表面修飾的2-AP的分子數(shù)量有限，且部分2-AP分子的熒光會被Au NCs猝滅，導致2-AP/BSA-Au NCs熒光較弱。為了得到熒光較強的2-AP/BSA-Au NCs探針，在c(2-AP)=4 mmol/L對Au NCs交聯(lián)進行了考察，在不同激發(fā)波長(從上到下依次為300、310、320、330、340、350、400 nm)條件下進行熒光光譜測試，見圖5。

由圖5可知，激發(fā)波長為300 nm時2-AP/BSA-Au NCs在384 nm和643 nm處的熒光強度最大。其中，圖5b相對于圖5a和圖5c位于384 nm和643 nm處的熒光強度相對較大，說明BSA-Au NCs的濃度影響2-AP/BSA-Au NCs的熒光強弱。在濃度較低的情況下，即使有足夠多的功能分子2-AP，但是通過交聯(lián)修飾到Au NCs表面的分子較少而導致熒光較弱。在較高的濃度條件下，BSA-Au NCs會對2-AP的熒光造成一定的猝滅，因此BSA-Au NCs只有在合適的濃度下，既可以修飾數(shù)量較多的2-AP分子，又不會對其熒光信號造成衰減。因此，選擇功能分子c(2-AP)=4 mmol/L,c(BSA-Au NCs)=13 μmol/L來進行交聯(lián)反應制備2-AP/BSA-Au NCs熒光探針。

λ/nma c(BSA-Au NCs)=20 μmol/L

λ/nmb c(BSA-Au NCs)=13 μmol/L

λ/nmc c(BSA-Au NCs)=6 μmol/L

λ/nmd 激發(fā)波長為300 nm圖5 BSA-Au NCs在不同條件下熒光光譜曲線

2.3 2-AP/BSA-Au NCs對TNT的熒光分析

TNT的引入可以有效地猝滅2-AP/BSA-Au NCs的熒光，因此可以應用于TNT的檢測，2-AP/BSA-Au NCs與TNT作用前后的光譜曲線見圖6。

λ/nm圖6 加入10 μmol/L TNT前后2-AP/BSA-Au NCs的熒光光譜曲線

由圖6可知，TNT由于苯環(huán)上硝基強烈的吸電子作用，導致TNT成為較好的缺電子體(即電子受體)，當富電子的熒光物質(zhì)與TNT相互作用會發(fā)生熒光猝滅?；赥NT的缺電子性很多文獻報道了多種傳感器[9]，尤其是和氨基類的化合物以及一些熒光納米材料。

基于文獻報道及實驗結果，認為TNT對2-AP/BSA-Au NCs的熒光猝滅效應可能是由于其強烈的缺電子性導致兩者之間發(fā)生光誘導的電子轉(zhuǎn)移反應，導致富電子的2-AP和BSA-Au NCs熒光均發(fā)生猝滅?；诖?，構建了基于2-AP/BSA-Au NCs熒光探針的熒光分析新方法，進行TNT的分析檢測，見圖7。

圖7 2-AP/BSA-Au NCs熒光探針對TNT的檢測原理示意圖

將TNT標準溶液加入2-AP/BSA-Au NCs分散液中在最優(yōu)的條件下測定2-AP/BSA-Au NCs與不同濃度TNT作用后的熒光光譜曲線，從上到下依次為c(TNT)=0.2、0.5、1.5、3.2、4.0、6.0、10.0 μmol/L，并作標準曲線，見圖8。

λ/nma 2-AP/BSA-Au NCs加入不同濃度TNT的熒光光譜圖

c(TNT)/(μmol·L-1)b 標準曲線圖圖8 2-AP/BSA-Au NCs加入不同濃度TNT的熒光光譜圖和標準曲線圖

由圖8可知，隨著c(TNT)逐漸增大(從0.2 μmol/L到10.0 μmol/L)，探針在384 nm和643 nm處的熒光強度隨之降低，證明TNT能夠不同程度地將探針的熒光猝滅。通過熒光探針分別在643 nm和384 nm處的熒光強度變化[(I640-I380)/100]作為標準來衡量TNT對雙信號熒光探針的猝滅程度。發(fā)現(xiàn)當c(TNT)=0.2～6.0 μmol/L，雙信號熒光探針的(I640-I380)/100信號變化與c(TNT)呈良好線性關系，相應回歸方程及相關系數(shù)分別為y=-0.211 18x+ 3.407 03，r=0.982 4，檢出限為0.14 μmol/L(S/N=3)，已遠遠低于中國飲用水源污染排放標準規(guī)定的TNT的最低檢出限值0.001 μg/L[10],因此具有較好的實際應用意義。根據(jù)金納米簇熒光強度變化和TNT濃度之間的關系，可以建立一種定量檢測TNT的熒光分析方法。

2.4 選擇性研究

選擇性是衡量分析方法的重要性能指標之一。環(huán)境體系復雜且存在多種環(huán)境污染物。基于此，選擇了環(huán)境體系中普遍存在的一些共存污染物，如硝基苯、苯酚、萘酚、苯胺等考察了該熒光探針的選擇性，c(共存污染物)=30.0 μmol/L、c(TNT)=6.0 μmol/L，見圖9。

圖9 2-AP/BSA-Au NCs選擇性實驗

由圖9可知，2-AP/BSA-Au NCs與TNT作用后熒光變化較為顯著，而與其他污染物作用后熒光變化很小，結果表明該熒光探針對缺電子的TNT具有較好的選擇性。

3 結 論

采用了環(huán)境友好的2-AP作為功能分子，通過EDC/NHS交聯(lián)的方法將2-AP修飾于BSA-Au NCs表面，合成了一種雙信號的金納米簇熒光探針。由于TNT強烈的缺電子性，與富電子的嘌呤環(huán)和金納米簇通過電子轉(zhuǎn)移作用使金納米簇的熒光猝滅，基于此發(fā)展了缺電子-富電子相互作用的熒光傳感器設計的新方法，實現(xiàn)了對典型環(huán)境污染物TNT的雙信號熒光檢測，檢出限可達0.14 μmol/L。結果表明，相對于其他硝基芳烴和一些共存的環(huán)境污染物，TNT對2-AP/BSA-Au NCs雙信號熒光探針的信號具有較明顯的猝滅作用，具有良好的選擇性。此外，該熒光探針的合成設計簡單，不存在二次環(huán)境污染和光漂白現(xiàn)象。這不僅解決了傳統(tǒng)的熒光材料在傳感器設計方面的缺陷，也為熒光法檢測TNT提供了一種新策略，有望發(fā)展成為靈敏、快速的環(huán)境污染物的熒光檢測方法。