外源油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗生長及生理特性的影響

周偉江，吳旺嬪，唐才寶，肖志芳，陳光輝，王 悅

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,長沙 410128；2.水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410128)

低溫是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量最主要的逆境之一[1]。水稻作為中國主要的糧食作物之一，在早春常遇到“倒春寒”天氣，導(dǎo)致水稻秧苗遭受低溫冷害，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的生理活性極強(qiáng)的植物激素[2]。大量研究表明，2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)可以顯著增強(qiáng)植物的抗逆性。李杰等[3]研究發(fā)現(xiàn)，噴施EBR能夠緩解低溫脅迫對(duì)辣椒幼苗生長的抑制作用，表現(xiàn)為地上部干物質(zhì)的增加，植株抗低溫能力增強(qiáng)。Hu等[4]研究表明，EBR預(yù)先處理黃瓜，能夠提高植株光合速率和光化學(xué)效率，進(jìn)而增強(qiáng)黃瓜幼苗低溫耐受能力。李淑葉等[5]證明，噴施EBR能夠減輕低溫脅迫對(duì)棉花幼苗細(xì)胞膜的損害，通過提高葉綠素含量、提升PSⅡ反應(yīng)中心活性和增強(qiáng)PSⅡ受體側(cè)電子傳遞能力，進(jìn)而提高低溫脅迫下棉花幼苗的光合能力。丁丹陽等[6]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下對(duì)煙草幼苗噴施EBR不僅能顯著促進(jìn)幼苗的生長和根系發(fā)育，通過提高葉綠素含量增強(qiáng)其光合速率，還能降低O2-產(chǎn)生速率，從而減少對(duì)幼苗的損傷，增強(qiáng)其耐旱能力。

目前關(guān)于油菜素內(nèi)酯的研究大多集中于逆境脅迫下植物的光合作用效率[7]、生理特性[8]、種子萌發(fā)[9]等方面的影響，而對(duì)低溫脅迫下油菜素內(nèi)酯對(duì)水稻幼苗生長及生理特性的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究以‘湘早秈45號(hào)’為材料，通過不同濃度EBR噴施處理，測(cè)定低溫脅迫下幼苗生長形態(tài)指標(biāo)、丙二醛含量和抗氧化酶活性等，為水稻幼苗低溫耐受機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻(OryzasativaL)品種為‘湘早秈45號(hào)’，由湖南省水稻研究所提供；EBR購買于美國Sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

EBR先用乙醇溶解，再用蒸餾水定容，配成6個(gè)濃度，分別為0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0 μmol/L。挑選粒型整齊一致的水稻種子，經(jīng)φ=40%次氯酸鈉溶液消毒40 min后，再用滅菌蒸餾水浸種24 h，將浸種后的水稻種子清洗 3～5次，置于37 ℃進(jìn)行催芽，催芽24 h后播種于留孔的PCR板中，置于盛有蒸餾水的定制培養(yǎng)盒進(jìn)行培養(yǎng)。用蒸餾水進(jìn)行緩苗，3 d后用1/2營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗生長至一葉一心期時(shí)，再用全營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，營養(yǎng)液參照國際水稻研究所公布的水稻營養(yǎng)液配方，每3 d換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)環(huán)境溫度(25±0.5) ℃，濕度(75±5)%。試驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)處理：CK1，常溫下噴施蒸餾水；CK2，低溫下噴施蒸餾水；T1，低溫下噴施0.001 μmol/L EBR；T2，低溫下噴施0.01 μmol/L EBR ；T3，低溫下噴施0.1 μmol/L EBR ；T4，低溫下噴施1.0 μmol/L EBR ；T5，低溫下噴施10.0 μmol/L EBR。待幼苗生長至兩葉一心期時(shí)，于20:00用不同濃度EBR進(jìn)行葉面噴施，為了增強(qiáng)葉片對(duì)EBR的吸收效果，在噴施溶液中加入φ=0.1%的吐溫20，每個(gè)PCR板噴施5 mL處理液，連續(xù)噴施3 d后放入RLD-1000E-4人工氣候箱(寧波樂電儀器制造有限公司)進(jìn)行處理，每個(gè)處理6盆幼苗，每盆4個(gè)PCR板，每板48株幼苗，重復(fù)4次。常溫對(duì)照溫度為25 ℃/25 ℃(晝/夜)，低溫處理溫度為4 ℃/4 ℃(晝/夜)，白天光照度為 4 000 lx。光照時(shí)數(shù)12 h，相對(duì)濕度80%。于低溫處理前(0 d)、低溫處理后 3 d取樣并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長量 選取長勢(shì)一致的幼苗20株，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)定距根基部1 cm處莖粗(水稻幼苗莖稈為橢圓形，測(cè)定長軸長度)，用直尺測(cè)量根基部到生長點(diǎn)的株高。蒸餾水將根系沖洗干凈后用吸水紙吸干，用萬分之一電子天平(Mettler Toledo ME 104E，瑞士)測(cè)定植株地上部分與地下部分鮮質(zhì)量。將新鮮樣品進(jìn)行105 ℃殺青30 min后，60 ℃烘至恒量，用萬分之一天平測(cè)定干質(zhì)量。

壯苗指數(shù)=(莖粗/株高 + 根干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量)×全株干質(zhì)量。

1.3.2 根系形態(tài)分析 選取長勢(shì)一致的植株20株，用HT2A-3獨(dú)立版型掃描儀(上海中晶科技有限公司，中國)掃描幼苗根系圖片并保存，用Microtek ScanWizard EZ型根系形態(tài)分析系統(tǒng)(上海中晶科技有限公司，中國)進(jìn)行分析，得出根系長度、表面積、體積、平均直徑、連接數(shù)、根尖數(shù)。

1.3.3 抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo) 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[10]；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用Kochba等[11]的方法測(cè)定；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用Aebi[12]的方法測(cè)定；丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用Hodges等[13]的硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性蛋白(soluble protein, SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)(α= 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗形態(tài)的影響

由表1可知，低溫處理前(0 d)，T4處理相比對(duì)照(CK1、CK2)，其地上部分鮮質(zhì)量、地上部分干質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量以及壯苗指數(shù)均顯著提高，分別增加13.55%、 23.68%、18.35%、20.99%和28.57%。低溫處理3 d后，水稻幼苗生長會(huì)受到抑制，而T4處理的水稻幼苗株高、莖粗、地上部分鮮質(zhì)量、地上部分干質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量以及壯苗指數(shù)較CK2分別提高9.65%、9.22%、 17.04%、26.76%、26.32%、29.41%和40.74%，均達(dá)到顯著性差異。

2.2 EBR對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗根系形態(tài)的 影響

由表2可知，低溫處理前(0 d)，適宜濃度EBR能促進(jìn)低溫脅迫下水稻幼苗根系的生長，以T2和T4處理效果較好，而T5處理會(huì)抑制水稻幼苗根系的生長。低溫處理3 d后，T4處理表現(xiàn)最好，其水稻幼苗根系的長度、表面積、體積、連接數(shù)和根尖數(shù)均顯著提高，較CK2分別增加 34.29%、25.19%、14.42%、32.02%和42.8%。

2.3 EBR對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，低溫處理前(0 d)，水稻幼苗葉片與根系的抗氧化酶活性隨EBR濃度的增大呈先增加后下降的趨勢(shì)，并以T4處理效果較好，其幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性相比CK2分別顯著增加了47.71%、19.61%和21.44%；幼苗根系較CK2分別提高了38.37%、27%和50%，均達(dá)到顯著性差異。低溫處理3 d后，水稻幼苗根系SOD、POD、CAT活性增強(qiáng)，以T4處理表現(xiàn)最好，較CK2顯著提高 47.15%、14.88%和73.92%。

表1 EBR處理及低溫脅迫下水稻幼苗形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of rice seedlings under EBR treatment and chilling stress

表2 EBR處理及低溫脅迫下水稻幼苗根系形態(tài)特征Table 2 Root morphological characteristics of rice seedlings under EBR treatment and chilling stress

2.4 EBR對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗MDA及SP含量的影響

由圖2可知，低溫處理前(0 d)，噴施EBR能顯著降低水稻幼苗葉片和根系的MDA含量，并增加其SP含量。其中，T4處理的水稻幼苗葉片中MDA含量相比CK2顯著降低了25.09%，而SP含量則顯著增加67.73%；根系中MDA含量較CK2顯著降低20.21%，而SP含量則顯著增加163.82%。低溫處理3 d后，T4處理效果最為明顯，其水稻幼苗葉片和根系的MDA含量相比CK2分別顯著降低30.19%和34.03%，而SP含量則分別顯著增加41.71%和56.48%。

圖中不同小寫字母表示同一時(shí)期同一指標(biāo)處理間差異顯著(P<0.05)。下同

圖2 EBR處理及低溫脅迫下水稻幼苗MDA及SP含量Fig.2 MDA and SP content of rice seedlings under EBR treatment and chilling stress

3 討 論

低溫脅迫主要通過減小幼苗葉片的柵欄組織厚度，造成植株生物量減少，從而影響植株形態(tài)建成、物質(zhì)合成與積累[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，10 ng/L的BR處理幼苗第二節(jié)間，便可以引起該節(jié)間顯著伸長，促進(jìn)細(xì)胞分裂，造成節(jié)間膨大，甚至開裂[16]。王道平等[17]研究表明，低溫脅迫使水稻幼苗單株鮮質(zhì)量顯著減少，而EBR對(duì)單株鮮質(zhì)量無明顯影響。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下水稻幼苗生長受到顯著的抑制作用，但噴施1.0 μmol/L EBR具有明顯的緩解作用，表現(xiàn)在幼苗的株高和莖粗均得到顯著提升，幼苗地上部和地下部干鮮質(zhì)量、壯苗指數(shù)和根冠比均較低溫對(duì)照有顯著的提高。這與徐曉昀等[7]、閆慧萍等[9]的研究結(jié)果一致，這可能與EBR能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和伸長，改善滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植株抗逆能力有關(guān)。

根系是植物吸收水分與礦質(zhì)養(yǎng)分的主要器官，其形態(tài)及構(gòu)型在極大程度上決定著植株獲取養(yǎng)分的能力[18]?？翟破G等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下黃瓜幼苗根系生長遭受了明顯的抑制作用，噴施EBR則能有效緩解這種抑制作用。趙雪松等[20]研究證明，1.0 μmol/L EBR處理6 h后，植株體內(nèi)結(jié)合態(tài)生長素轉(zhuǎn)化為游離態(tài)生長素的過程受到顯著抑制，致使根尖頂端優(yōu)勢(shì)的喪失，從而促進(jìn)側(cè)根的生長發(fā)育。閆小紅等[21]研究表明，在低溫15 ℃下，無論是浸泡法還是添加法，不同濃度EBR對(duì)辣椒幼苗根長均表現(xiàn)為抑制作用。本試驗(yàn)研究表明，1.0 μmol/L EBR處理能極大地促進(jìn)水稻幼苗根系生長，使根系長度、表面積、體積、平均直徑、連接數(shù)及根尖數(shù)顯著增加，而在低溫脅迫下水稻幼苗根系生長受抑制，但噴施EBR能極大地緩解這種抑制作用。這可能與EBR能夠在低溫脅迫下，通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子BZR1，激活參與細(xì)胞壁形成的相關(guān)基因，促進(jìn)根系細(xì)胞伸長有關(guān)。大量研究也表明，EBR能夠通過與生長素互作，調(diào)控快速堿化因子，調(diào)節(jié)側(cè)根發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞的縱向生長[22-23]。

綜上所述，低溫脅迫下，適宜濃度的EBR能通過提高水稻幼苗株高、莖粗、地上與地下部分干鮮質(zhì)量、壯苗指數(shù)及根冠比，增加根系長度、表面積、體積、平均直徑、連接數(shù)以及根尖數(shù)，增強(qiáng)葉片與根系中抗氧化酶(SOD、POD、CAT) 活性，降低MDA含量，加快SP含量積累來緩解低溫對(duì)水稻幼苗的傷害。因此，低溫脅迫下噴施1.0 μmol/L EBR溶液能明顯減輕低溫脅迫對(duì)水稻幼苗生長的抑制作用，增強(qiáng)其低溫耐受能力。