無刺枸骨果實(shí)化學(xué)成分及其抗氧化和抑菌活性研究

佘新松，翟大才，胡宗浩，滕蕓蕓，朱雯培，李士壯，柏曉輝

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041)

無刺枸骨（Ilex cornutavar.fortunei），是冬青屬（IlexL.）植物枸骨（Ilex cornutaLindl. et Paxt.）的自然變種，是一種常綠小喬木或灌木，其葉形奇特，球形核果入秋成熟轉(zhuǎn)紅，鮮艷奪目，是一種良好的觀賞樹種[1]。枸骨在我國長江下游各省均有分布，且其根、樹皮、葉與果實(shí)等均可入藥，具有益腎、活絡(luò)強(qiáng)筋等功效，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)酸痛、腰肌勞損等病癥[2]。此外，有文獻(xiàn)報道，無刺枸骨具有降血脂、抗生育和抑菌等作用[3]，但具體作用機(jī)制不明。

目前，關(guān)于無刺枸骨的研究主要集中在無刺枸骨快速繁殖與扦插技術(shù)[4-5]、嫁接與造型技術(shù)[6]，無刺枸骨葉片結(jié)構(gòu)對環(huán)境溫度的適應(yīng)[7]、枸骨和無刺枸骨不同光強(qiáng)下光合能力比較[8]，無刺枸骨不同部位齊墩果酸和熊果酸的含量分析[1]及果實(shí)總黃酮的提取及穩(wěn)定性研究[3]等，對無刺枸骨果實(shí)化學(xué)成分的研究較少，而對其果實(shí)抗氧化和抑菌活性研究仍處于空白階段。本文以無刺枸骨果實(shí)為對象，采用多種極性不同的溶劑分別對其果實(shí)的活性物質(zhì)進(jìn)行萃取，并采用2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、濾紙片抑菌法檢測其活性物質(zhì)的抗氧化活性與抑菌活性；同時結(jié)合GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）技術(shù)對抗氧化及抑菌活性顯著的正丁醇萃取物化學(xué)組成進(jìn)行分析鑒定，以期為無刺枸骨果實(shí)資源的綜合利用與開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 儀器設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋（SQ510C型，重慶雅馬拓科技公司）、恒溫培養(yǎng)箱（ZGP-2 050型，上海智城分析儀器公司）、超凈工作臺（ZHJH-C1106B型，上海智城分析儀器公司）、紫外可見分光光度計（UV754N型，上海精密科學(xué)儀器公司）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7 890 A-5 975C型，美國Agilent公司）。

1.1.2 試劑 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購于東京化成株式會社，均為分析純；無水乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、過硫酸鉀等試劑購于上海國藥集團(tuán)，均為分析純；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉和維生素C等生化試劑購于上海生工有限公司。

1.1.3 實(shí)驗材料 實(shí)驗所用的無刺枸骨成熟期果實(shí)（憑證標(biāo)本采集號-03；采集人：佘新松；鑒定人：方建新；采集地點(diǎn)：安徽屯溪；采集時間：2019年12月4日）采集于黃山學(xué)院校園內(nèi)。

本文抑菌實(shí)驗所用菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris），以上菌株保存于黃山學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗中心且均購自于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。抑菌實(shí)驗所用固體培養(yǎng)基為LB（Luria-Bertani）平板培養(yǎng)基，其配制方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 無刺枸骨果實(shí)成分的提取 將采集的新鮮無刺枸骨果實(shí)去果梗后粉碎至糊狀，稱取20.0 g糊狀果實(shí)于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL甲醇并于60 ℃恒溫萃取3 h；過濾后收集上清液，并向濾渣中再加入新甲醇200 mL后重復(fù)提取2次；將3次提取液合并后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)60 ℃真空蒸干得到甲醇粗提物，收集并稱質(zhì)量后用100 mL雙蒸水重懸甲醇粗提物，再按1:1等體積比依次加入100 mL正丁醇、乙酸乙酯和石油醚進(jìn)行萃取，各萃取溶劑分別重復(fù)3次，收集300 mL各萃取相溶劑后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)60 ℃減壓旋干并稱質(zhì)量；最后用無水乙醇分別將上述萃取物配制成10 mg·mL-1溶液，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 無刺枸骨果實(shí)萃取物對ABTS自由基的清除能力 參考文獻(xiàn)[10]方法檢測并改進(jìn)無刺枸骨果實(shí)萃取物清除ABTS自由基的能力，方法如下：按體積比1∶1分別移取2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液與7 mmol·L-1ABTS溶液混勻并避光反應(yīng)12 h；用甲醇將反應(yīng)后ABTS液稀釋至λ734nm吸光值為0.68～0.72待用。分別移取無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物不同濃度溶液200 μL于2 mL上述甲醇稀釋后的ABTS溶液中，混勻后于暗處室溫反應(yīng)6 min測其吸光值A(chǔ)x。以相同方法測定200 μL甲醇與2 mL反應(yīng)后的ABTS溶液反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)0；同時，測定100 μL不同濃度的無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物溶液與2 mL甲醇反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)y，每組重復(fù)測定3次。以Vc為陽性對照，采用上述方法測定其清除ABTS自由基的能力，重復(fù)3次。按公式（1）計算清除ABTS自由基的清除率(Y)，取其平均值進(jìn)行分析。

1.2.3 無刺枸骨果實(shí)萃取物對DPPH自由基的清除能力 參考文獻(xiàn)[11]方法并適當(dāng)改善檢測無刺枸骨果實(shí)萃取物清除DPPH自由基的能力，方法如下：分別移取經(jīng)無水乙醇稀釋的無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物溶液100 μL于0.06 mmol·L-1DPPH-乙醇（95%）溶液中配制成一系列不同濃度的溶液，混勻并避光反應(yīng)20 min后于λ517nm處測定吸光值Bx。同時，吸取100 μL無水乙醇至DPPH-乙醇（95%）溶液中作為對照組，測定其吸光值B0。以Vc為陽性對照，采用上述方法測定其清除DPPH自由基的能力，重復(fù)3次。按公式（2）計算清除DPPH自由基的清除率（Z），取平均值進(jìn)行分析。

1.2.4 無刺枸骨果實(shí)萃取物的抑菌活性 參考文獻(xiàn)[9]方法檢測無刺枸骨果實(shí)萃取物對不同受試菌的抑菌活性，方法如下：將活化后的受試菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和變形桿菌培養(yǎng)至λ600nm處吸光值為0.25～0.35，吸取100 μL上述菌液于LB固體培養(yǎng)基上涂布均勻，放置直徑6 mm無菌濾紙片，分別吸取10 μL無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物滴加于紙片中央；以無水乙醇為空白對照，將以上LB固體培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)12 h，測量并記錄抑菌圈的大小，重復(fù)3次，以其均值進(jìn)行分析。

1.2.5 無刺枸骨果實(shí)正丁醇萃取物GC-MS分析依據(jù)文獻(xiàn)[12-13]的方法并改進(jìn)，采用HP-5 MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）為色譜柱對無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物進(jìn)行GC-MS分析，萃取物進(jìn)樣量為0.5 μL；以純度99.999 %氦氣作為載氣，流速設(shè)置為1.0 mL·min-1；柱箱采取程序梯度升溫：起始溫度設(shè)置為50℃，先以4℃·min-1速率升至150℃后保持1 min，再以1℃·min-1速率升至220℃后維持1 min，最后以3℃·min-1速率升至260℃后維持5 min，共運(yùn)行50 min。

采用電子轟擊（EI）離子源，70 eV電子能量；設(shè)置離子源為230℃，四極桿為150℃；掃描質(zhì)量數(shù)范圍m/z為50.0～500.0，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫選擇為標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST08。

1.2.6 無刺枸骨果實(shí)正丁醇萃取物UPLC-Q-TOF/MS分析 參考文獻(xiàn)[14-16]中的方法并適當(dāng)修改測定正丁醇萃取物的成分，具體參數(shù)簡述如下：取1 μL待測樣品注入UPLC儀器中，設(shè)置流速為0.3 mL·min-1；采用ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫恒定為30℃；流動相分別為0.1%甲醇水溶液（A）和乙腈（B）；洗脫程序設(shè)置為：0～10 min，5% B；10～20 min，20% B；20～28 min，40% B；28～38 min，60%B；38～43 min，100% B；43～46 min，100% B；46～50 min，5% B。采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度設(shè)為100℃，脫溶劑氣（N2）溫度為400℃；毛細(xì)管電壓設(shè)為2.0 kV，錐孔電壓為40 V；錐孔氣（N2）流量設(shè)為50 L·h-1；利用氬氣作為碰撞氣，碰撞能量為6 V和20～30 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 無刺枸骨果實(shí)萃取物的抗氧化活性

2.1.1 無刺枸骨果實(shí)萃取物對ABTS自由基的清除作用 將無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物稀釋為一系列濃度梯度，檢測其對ABTS自由基的清除作用。圖1表明：無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯與石油醚萃取物對ABTS自由基的清除作用均與萃取物濃度呈正相關(guān)，即ABTS自由基清除率隨萃取物濃度增加而增大，當(dāng)正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物濃度分別為0.075、0.125、0.625 mg·mL-1時，對ABTS自由基清除率分別為99.68%、99.95%、53.21%。陽性對照Vc濃度（X）與ABTS自由基清除率（Y）的線性回歸方程為：Y=20 783.00X+5.94 (R2=0.971 1)。無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物及Vc對ABTS自由基清除作用的ED50值分別為0.033 6、0.054 0、0.559 1、0.002 1 mg·mL-1。

圖1 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇(A)、乙酸乙酯(B和石油醚(C)萃取物對ABTS自由基的清除作用。Fig. 1 Free radical scavenging assays of the 1-butanol (A), ethyl acetate (B), and petroleum ether (C) extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei against ABTS

2.1.2 無刺枸骨果實(shí)萃取物對DPPH自由基的清除作用 分別取無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物稀釋為一系列梯度，檢測其對DPPH自由基的清除作用。圖2可知：無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯與石油醚萃取物對DPPH自由基的清除作用均與萃取物濃度呈正相關(guān)，且隨著萃取物濃度增加，DPPH清除率顯著增大。當(dāng)正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物濃度分別為0.125、0.25、1.25 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率分別為90.83%、98.15%、75.50%。陽性對照Vc濃度（X）與DPPH自由基清除率（Y）的線性回歸方程為：Y=18 986.00X+4.49 (R2=0.987 3)。無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物及Vc對ABTS自由基清除作用的ED50值分別為0.054 3、0.096 4、0.774 1、0.002 4 mg·mL-1。

圖2 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇(A)、乙酸乙酯(B和石油醚(C)萃取物對DPPH自由基的清除作用Fig. 2 Free radical scavenging assays of the 1-butanol (A), ethyl acetate (B), and petroleum ether (C) extraction from the crude methanol extract of of the fructus of I. cornuta var fortunei against DPPH

2.2 無刺枸骨果實(shí)萃取物的抑菌作用

以濾紙片抑菌法檢測無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌與變形桿菌的抑菌活性。圖3結(jié)果表明：正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對上述5種受試菌均有抑制作用。與對照乙醇相比，正丁醇萃取物的抑菌效果最顯著，對5種受試菌的抑制作用順序為：鼠傷寒沙門氏菌＞變形桿菌＞枯草芽孢桿菌＞綠膿桿菌＞金黃色葡萄球菌，抑菌圈減去同條件下乙醇對照的均值分別為6.20、5.15、4.24、3.45、3.24 mm；乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和變形桿菌有顯著抑制作用，對金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌無顯著抑制作用；石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌有顯著抑制作用，對綠膿桿菌和變形桿菌無顯著的抑制作用。

圖3 無刺枸骨果實(shí)萃取物對不同受試菌的抑菌作用Fig. 3 Antibacterial activity of the solvent extraction of the fructus of I. cornuta var fortunei against the different tested bacteria

圖4 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物GC-MS總離子流Fig. 4 The total ion chromatogram of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS

2.3 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物化學(xué)成分分析

2.3.1 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提物的正丁醇萃取物GC-MS分析 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物抗氧化活性和抑菌效果最好，故采用GCMS技術(shù)對其進(jìn)行化學(xué)組成分析，總離子流結(jié)果見圖4。通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST08的質(zhì)譜峰比對分析，結(jié)合峰面積歸一法分析其各組分的相對含量（表1）。由圖4和表1可知：無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物中共分離出色譜峰35個，經(jīng)鑒定后得到14個化合物（表1），占正丁醇萃取物總量的83.15%，其相對含量高于1.00%的化合物依次為N1-(叔丁基)-2-(2-[2-[(叔丁基氨基)碳硫基]肼基]亞乙基)肼-1-碳硫酰胺（48.63%）、丁醛二丁基乙縮醛（25.53%）、1-丁氧基-2-乙基-1-己烯（2.37%）、丁酸丁酯（1.67%）和丙位癸內(nèi)酯（1.04%），這5種組分占總化合物的79.24%。

表1 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的GC-MS鑒定結(jié)果Table 1 The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS

2.3.2 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提物的正丁醇萃取物UPLC-Q-TOF/MS分析 利用UPLC-Q-TOF/MS同時對無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物化學(xué)組成進(jìn)行定性分析，其總離子流結(jié)果見圖5，推測和鑒定出化合物共10種（表2）。從表2可知：鑒定出的10種化合物含有2種乙酰腈、2種酯類、3種羧酸、2種酮類和1種酰胺。

圖5 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物UPLCQ-TOF/MS總離子流Fig. 5 The total ion chromatogram of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by UPLC-Q-TOF/MS

3 討論

現(xiàn)有研究表明，枸骨具有降血脂、抗生育和抑菌等作用[3]，但具體藥用分子不明。為探究無刺枸骨成熟果實(shí)中的藥效分子，本文首次利用不同極性的有機(jī)溶劑正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等溶劑對其生物活性成分進(jìn)行萃取，并證明其萃取物具有非常好的抗氧化性；同時，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性較好的成分主要富集在正丁醇相中。利用抑菌試驗，本文證明無刺枸骨果實(shí)成分具有較好的抑菌活性，這與現(xiàn)有的報道相吻合[3]。通過比較正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物的抑菌活性可發(fā)現(xiàn)，抑菌活性較好的生物活性成分也富集在正丁醇萃取物中，但具體的生物活性分子不明。

表2 無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的UPLC-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果Table 2 The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by UPLC-Q-TOF/MS

采用GC-MS與UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對正丁醇萃取物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無刺枸骨果實(shí)中存在化合物(1S,3R,4R,5R)-3-((3-(3,4-二羥基苯基)丙烯酰)氧代)-1,4,5-三羥基環(huán)己羧酸，該化合物又稱為綠原酸[17]。現(xiàn)有研究表明，綠原酸是很多藥材和中成藥具有消炎利膽、抗菌解毒的主要藥效分子[17]；其具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，也具有顯著的抗菌、抗病毒作用[17]。因此，正丁醇萃取物具有很強(qiáng)的抗氧化和抑菌活性可能與其含有綠原酸有關(guān)。同時，UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)顯示，無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇萃取物中的化合物比較多，值得進(jìn)一步發(fā)掘。

4 結(jié)論

通過測定無刺枸骨果實(shí)甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對ABTS和DPPH自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)萃取物均有較好的抗氧化性，其中，正丁醇萃取物的抗氧化能力最好。抑菌試驗表明，以上3種萃取物的抑菌能力為正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。通過GC-MS和UPLC-QTOF/MS技術(shù)對正丁醇萃取物成分的分析，本文首次報道綠原酸是無刺枸骨果實(shí)的重要藥效分子，這為無刺枸骨果實(shí)的綜合開發(fā)與利用提供了數(shù)據(jù)支持。