杉木人工林土壤溶磷細菌篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

韋宜慧，陳嘉琪，董玉紅，厚凌宇，焦如珍

(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

磷是植物生長和發(fā)育的重要營養(yǎng)元素之一，參與植物的重要代謝途徑，如光合作用，養(yǎng)分吸收及細胞分裂[1-2]。然而土壤中的磷大部分是難以利用的難溶性磷酸鹽，可被植物直接吸收利用的水溶態(tài)磷含量低，土壤磷利用率通常只有10%～15%，少部分植物利用率達到25%[3-4]。因此，磷常常成為限制植物生產(chǎn)力的主要因素之一。杉木是我國南方特有的速生用材樹種，木材產(chǎn)量超過了全國商品用材的四分之一[5]。然而南方地區(qū)淋溶強烈，土壤富含鋁離子和鐵離子，磷極易被固定，土壤磷利用率極低，嚴重制約了杉木人工林可持續(xù)發(fā)展[6]。因此，越來越多的研究已經(jīng)轉向土壤磷可持續(xù)利用。眾多研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在大量具有溶磷能力的微生物，這些微生物通過自身代謝作用，將土壤中的難溶性磷酸鹽轉化為植物可吸收利用的水溶性磷[7-9]。開發(fā)利用溶磷微生物，提高土壤磷利用率，已經(jīng)成為當前研究熱點。目前大多數(shù)報道的溶磷微生物菌分離自農(nóng)作物，Mukhtar[10]等從甘蔗根際分離出2株高效溶磷細菌，均屬芽孢桿菌屬（Bacillus），Zhao等[11]從玉米根際篩選到1株耐鹽的洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cepacia）。

紅壤是我國杉木種植區(qū)主要土壤類型之一，具有“酸”、“粘”、“瘦”的特點，土壤磷素有效性低，嚴重制約著杉木生產(chǎn)力的提高[12]。本研究從紅壤地區(qū)杉木人工林土壤分離篩選溶磷細菌，通過生理生化和16SrDNA基因序列確定其分類地位，運用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件，為杉木菌肥的開發(fā)利用提供高效溶磷菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與篩選

土壤樣品采自江西省大崗山山下林場（27°36′ N，114°24′ E）18年生杉木人工林，該區(qū)域屬于低山丘陵地貌，海拔220～300 m，土壤類型為紅壤。通過S形采樣法在樣地內(nèi)布設7個采樣點，用土鉆鉆取0～20 cm土壤，將7個采樣點土壤混合裝入滅菌袋后立即帶回實驗室，4℃保存。稱取10 g新鮮土樣，置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩30 min。將土壤懸浮液連續(xù)稀釋10倍至10-4，取0.05 mL稀釋度為10-3、10-4土壤懸浮液涂布于Pikovskaya(PVK)[13]瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)5～7 d，檢查平板是否存在產(chǎn)生透明暈圈的菌落。挑取溶磷圈明顯的菌落，用連續(xù)劃線法進一步純化。

采用鉬銻抗比色法[14]對菌株溶磷能力進行測定：在250 mL三角瓶中加入100 mL PVK液體培養(yǎng)基（磷酸鈣滅菌后加入），接入1 mL培養(yǎng)過夜的菌液，置于恒溫搖床中28℃，180 r·min-1培養(yǎng)7 d后測定菌株溶磷能力。

1.2 形態(tài)觀察及菌株鑒定

根據(jù)伯杰細菌鑒定手冊，研究菌株的生理生化特性。采用試劑盒法提取細菌基因組DNA，PCR擴增后進行16SrDNA測序。擴增引物為：27F：5′AG AGTTTGATCCTGGCTCAG3′；1492R：5′TACGG CTACCTTGTTACGACTT3′，擴增體系參考劉彩霞的方法[15]。測序結果在GenBank中進行比對，運用MEGA7構建系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌株分類地位。

1.3 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗 根據(jù)溶磷能力測定的結果，選擇溶磷能力強的菌株進行溶磷培養(yǎng)條件優(yōu)化。為了驗證菌株的溶磷能力，所有培養(yǎng)過程均采用PVK培養(yǎng)基。影響菌株溶磷能力的因素主要有培養(yǎng)時間、培養(yǎng)初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、碳源、氮源、磷源。通過單因素試驗，培養(yǎng)時間設置為24、48、72、96、120、144、168 h；培養(yǎng)基pH設置為4、5、6、7、8、9、10；培養(yǎng)溫度設置為10、15、20、25、30、35、40℃；接種量設置為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4%。分別以1%(w/v)、0.05%(w/v)、0.5%(w/v)的濃度提供不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉）、氮源（硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母浸粉）、磷源（磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁）。接種后置于恒溫搖床中28℃，180 r·min-1培養(yǎng)7 d，測定培養(yǎng)基中菌株生長量、有效磷含量，以未接種PVK液體培養(yǎng)基為對照。菌株生長量通過測定培養(yǎng)液在波長600 nm時的光密度值表示（OD600）。有效磷含量采用鉬銻抗比色法測定。

1.3.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗的結果，設計了蔗糖（2.0%，2.5%，3.0%），氯化銨（0.1%，0.15%，0.2%），pH（5，5.5，6），溫度（25℃，30℃，35℃）四因素三水平的正交試驗對溶磷條件進行優(yōu)化。選用L9(34)正交表，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels employed in orthogonal test

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件進行方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 溶磷能力測定

利用PVK平板分離杉木人工林土壤中的溶磷細菌，經(jīng)過多次純化得到13株具有明顯溶磷圈的細菌。各菌株溶磷能力如表2所示，培養(yǎng)液中有效磷含量在21.61～195.61 mg·L-1之間，有效磷含量最高的是P5(195.61 mg·L-1)。因此，選擇P5作為后續(xù)研究供試菌株。

2.2 菌株生理生化鑒定及16SrDNA序列分析

革蘭氏染色試驗表明菌株P5為革蘭氏陰性菌，在PVK瓊脂平板上28℃培養(yǎng)3 d后的菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，白色不透明且表面光滑濕潤，具有明顯溶磷圈。以下生理生化試驗為陽性：硝酸鹽還原試驗，葡萄糖試驗，阿拉伯糖試驗，甘露醇試驗以及檸檬酸鹽試驗。以下生理生化試驗為陰性：甲基紅試驗，氧化酶/VP試驗，硫化氫試驗，明膠水解試驗及丙二酸鹽試驗。

將菌株P5 16SrDNA序列與Genbank中的模式菌株序列進行比較，P5菌株與Burkholderia ubonensis序列相似度為99.09%，一致性為98.8%。選擇數(shù)據(jù)庫中相似度最高的7株標準菌株及1株外群菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。P5菌株與Burkholderia ubonensis同源，相似度和一致性均大于98%，置信度為78，結合生理生化判斷P5為Burkholderia ubonensis。

表2 菌株溶磷能力Table 2 Phosphorus solubilizing ability of bacterial strains

圖1 P5菌株系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig. 1 Phylogenetic tree of P5

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 菌株在不同碳源、氮源、磷源培養(yǎng)基中生長情況 由圖2可看出菌株生長量與有效磷含量對不同培養(yǎng)時間、pH、溫度及接種量的響應有顯著差異，但兩者之間無明顯相關性。培養(yǎng)時間對菌株溶磷量的影響如圖2a所示，培養(yǎng)基中菌株生長量隨著時間的增加先升高后降低，在72 h達到最大值，有效磷含量則在96 h達到最高后趨于平穩(wěn)。從圖2b可以看出pH在4～10范圍內(nèi)，有效磷含量和菌株生長量均呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的規(guī)律，P5生長適應范圍為5～6，最適pH為5。菌株生長量和有效磷含量在酸性條件下顯著高于堿性條件，表明P5耐低pH。溫度在10～40℃范圍內(nèi)，P5培養(yǎng)液中有效磷含量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖2c）。溫度在25～30℃之間，菌株生長量和有效磷含量均達到最大值。在40℃時菌株光密度值OD600大于1，顯著高于10～15℃，說明菌株較耐高溫。菌株生長量和有效磷含量都隨著接種量的增加先升高后降低（圖2d）。菌株生長量在接種量為3%時達到了最高點，而有效磷含量在接種量為2%時達到最大值。單因素試驗結果表明，菌株P5最適培養(yǎng)時間為72～96 h，最適pH為5～6，最適溫度在25 ～30℃之間，最適接種量為1.5%。

6種不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、淀粉）對菌株溶磷能力的影響差異顯著（圖3a），葡萄糖、蔗糖作為唯一碳源時，有效磷含量和菌株生長量顯著高于其余4種碳源。其中蔗糖是菌株P5的最佳碳源，其次為葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞甘露醇＞淀粉。為了確定蔗糖濃度對菌株解磷能力的影響，在0.5%～4%（w/v）范圍內(nèi)設置8個濃度蔗糖（梯度為0.5%）。圖3b表明隨著蔗糖濃度的增加，有效磷含量逐漸增加，蔗糖濃度為3%時有效磷含量最高，濃度繼續(xù)增加時有效磷含量無明顯變化。菌株生長量隨蔗糖濃度的增加先上升后下降，在濃度為1%～2%間達到最大值。不同蔗糖濃度下P5菌株生長量及溶磷量無明顯相關性。

將不同氮源（硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母浸粉）以0.05%（w/v）的濃度加入培養(yǎng)基中，測定不同氮源對有效磷含量的影響。如圖4a所示，在以硫酸銨和氯化銨為氮源時，菌株P5有效磷含量顯著高于其余4種氮源，其中氯化銨培養(yǎng)基中菌株生長量最高，是菌株P5溶解磷的最佳氮源。將氯化銨按0.05%～0.4%（w/v）范圍內(nèi)分8個濃度（梯度為0.05%）添加到培養(yǎng)基中，結果如圖4b，濃度為0.15%時培養(yǎng)基中有效磷含量最高，高于或低于該濃度的培養(yǎng)基有效磷含量均減少。氯化銨濃度對菌株生長的影響與有效磷含量變化一致，氯化銨濃度為0.2%、0.15%時菌株生長量和有效磷含量分別達到最高值。

由圖5a可知，3種不同磷源條件下，有效磷含量及菌株生長量大小排序為磷酸鈣＞磷酸鋁＞磷酸鐵。在0.5%～4%（w/v）范圍內(nèi)分8個濃度（梯度為0.5%）將磷酸鈣添加到培養(yǎng)基中，結果如圖5b所示，菌株P5在0.5%～4%（w/v）范圍內(nèi)有效磷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在1.5%濃度時有效磷含量達到最高。菌株生長量在濃度范圍為0.5%～1.5%之間無明顯變化，濃度增加至2%時菌株生長量顯著減少。

圖2 培養(yǎng)條件對P5溶磷能力的影響Fig. 2 Effect of culture conditions on the ability of P5 to dissolve phosphorus

圖3 不同碳源及不同蔗糖濃度對P5溶磷能力的影響Fig. 3 Phosphorus dissolving ability of P5 under different different carbon sources and sucrose concentrations

2.3.2 正交設計優(yōu)化 在單因素試驗的基礎上，選擇蔗糖、氯化銨、pH、溫度進行四因素三水平正交試驗。從表3和表4可知，因素B、C對菌株解磷能力影響顯著（P＜0.05），因素D極顯著（P＜0.01），因素A不顯著，影響P5溶磷能力的因素主次順序為D＞B＞C＞A，即溫度＞氯化銨＞pH＞蔗糖。由表3可知，因素A、B、C、D優(yōu)水平為A2、B3、C2、D2，優(yōu)組合為A2B3C2D2。由于因素A的水平改變對試驗結果幾乎無影響，從經(jīng)濟角度考慮，選A1，因此培養(yǎng)條件優(yōu)組合為A1B3C2D2，即蔗糖濃度為2.0%，氯化銨濃度為0.2%，pH為5.5，溫度為30℃。為了驗證該條件下P5溶磷能力，進行了補充試驗，試驗結果表明該條件下P5培養(yǎng)液中有效磷含量高達268.69 mg·L-1，顯著高于優(yōu)化前培養(yǎng)條件（PVK液體培養(yǎng)基），后者有效磷含量為195.61 mg·L-1。證明通過正交試驗，調(diào)整后的培養(yǎng)條件更有利于提高菌株P5的溶磷能力。

圖4 不同氮源及不同氯化銨濃度對P5溶磷能力的影響Fig. 4 Phosphorus dissolving ability of P5 under different different nitrogen sources and ammonium chloride concentrations

圖5 不同磷源及不同磷酸鈣濃度對P5解磷能力的影響Fig. 5 Phosphorus dissolving ability of P5 under different different phosphorus sources and calcium phosphate concentrations

3 討論

從杉木人工林土壤中篩選到一株高效溶磷菌株P5，通過生理生化試驗和16SrDNA基因序列分析鑒定為Burkholderia ubonensis。研究表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株生長量先上升后下降，而有效磷含量上升到最高后保持平穩(wěn)，可能是因為菌株生長達到了穩(wěn)定期，菌體繁殖速度開始下降，但菌株分泌的代謝產(chǎn)物在這段時間內(nèi)大量積累，促進了難溶性磷的溶解[16-17]。菌株P5生長最適pH范圍為5～6，最適溫度范圍為25～30℃。楊艷紅等[18]研究得出，芽孢桿菌的最適生長溫度和pH分別為37℃、7.0；劉曉璐等[19]從煙草根際分離的功能菌最適生長溫度為30℃，pH為7.5。研究表明，pH和溫度通過影響微生物體內(nèi)酶驅動過程而改變代謝速率，低溫條件下菌株生長繁殖緩慢，活力下降，高溫則容易導致菌體自溶[20]。接種量逐漸增加，菌株對空間和營養(yǎng)物質(zhì)的爭奪越強烈，導致細菌代謝速度逐漸減慢，代謝產(chǎn)物的累積速率減緩，從而導致有效磷含量減少，也可能是因為菌株生長過程產(chǎn)生了有毒代謝物質(zhì)或細胞的自溶作用減緩了細菌代謝速率[21-22]。土壤pH值對林木生長有重要影響，極酸、極堿立地不利于林木生長，改良需要花費大量人力物力，且微生物肥料使用受限，土壤質(zhì)量難以提高[23]。本研究篩選的P5菌株在4～10時均可生長，可在不同pH值土壤中應用。

表3 L9(34)正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal test

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal test

本研究篩選的P5菌株的最佳碳源和氮源分別是蔗糖和氯化銨，而喬志偉等[24]分離的具有溶磷能力的伯克氏菌W4的適宜碳源、氮源分別為葡萄糖和硝酸鉀。Park等[25]發(fā)現(xiàn)伯克氏菌Burkholderia vietnamiensi的最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和尿素。其原因可能與微生物代謝機制的多樣性以及不同碳、氮源的物理化學性質(zhì)有關，不同碳源和氮源通過改變微生物代謝路徑，導致其分泌的有機酸的種類和數(shù)量發(fā)生變化，從而改變了溶磷微生物的溶磷能力[26-29]。不同濃度碳源、氮源對不同菌株生長和溶磷效果影響不同，劉玉鳳[28]等分離的假單胞菌的最適葡萄糖濃度為1%；Park等[25]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為3.5%時Burkholderia vietnamiensi的生長量最大，有效磷含量最高。本研究中蔗糖濃度為3%時，菌株生長量和有效磷達到最大值，此時菌株分泌大量有機酸，抑制了微生物的生長代謝，導致菌株生長量開始下降，培養(yǎng)液有效磷含量增加受限；氮源濃度高則引起微生物對磷的吸收增加，從而降低有效磷含量[30]。不同磷源對溶磷微生物的溶磷能力與難溶性磷酸鹽的結構有關，本研究中菌株P5對磷酸鈣的溶解效果最佳。菌株溶磷機制包括以下幾種：分泌有機酸，呼吸酸化，NH4+同化，胞外酶水解[31-33]。Ca-P較易溶解可能與溶磷微生物分泌的有機酸種類有關，也可能是Ca-P的溶解是微生物分泌質(zhì)子和有機酸螯合陽離子雙重作用的結果，而Al-P和Fe-P只能通過螯合作用來釋放磷酸鹽[34-35]。磷源濃度也是影響溶磷微生物溶磷量的因素之一，磷濃度高，使微生物釋放的磷再次被陽離子固定，形成難溶性磷酸鹽，而低磷供應減少微生物蛋白質(zhì)合成，降低微生物活性[36]。培養(yǎng)條件優(yōu)化結果顯示pH值對菌株溶磷量的影響極顯著，溫度、氮源對菌株溶磷量影響顯著，這主要是因為菌株在不同培養(yǎng)條件下，基因調(diào)控及蛋白合成均會發(fā)生變化，從而引起菌株細胞膜通透性及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、菌株代謝產(chǎn)物及胞外酶活的變化[37-38]。然而，需要進一步研究以了解P5的溶磷機制，并在溫室或田間條件下探索其促生能力及促生機制。

4 結論

從杉木人工林土壤分離到1株耐酸，耐高溫的高效溶磷細菌Burkholderia ubonensisP5。單因素試驗表明P5最適培養(yǎng)時間為72～96 h，最適pH為5.0～7.0，最適溫度在25℃～30℃之間，最適接種量為1.5%，最適碳源為蔗糖，氮源為氯化銨，磷源為碳酸鈣。正交試驗表明P5在蔗糖濃度為2.0%，氯化銨濃度為0.2%，pH為5.5，溫度為30℃條件下溶磷能力顯著提高。對菌株溶磷條件進行優(yōu)化是有效發(fā)揮細菌溶磷能力的必要前提，為菌株P5的溶磷機制及其對植物生長的作用等后續(xù)研究奠定了基礎。