不同沙棘品種種子中α-亞麻酸含量差異及相關(guān)基因分析

張 彤，呂中睿，魏繼華，張國(guó)昀，羅紅梅，何彩云＊

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 磴口 015200)

沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬的一種雌雄異株的灌木或小喬木，耐旱性和耐寒性良好。沙棘果實(shí)具有獨(dú)特的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在中國(guó)和俄羅斯有上百年的藥用歷史[1]。沙棘果實(shí)富含維生素、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸、抗氧化劑和類(lèi)黃酮[2-4]，在炎癥性疾病、肝臟性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的治療以及保護(hù)心臟等方面具有顯著功效[5]。在沙棘種子含有的眾多脂肪酸中，α-亞麻酸（α-Linolenic acid，C18:3N3）的含量十分豐富，且α-亞麻酸對(duì)大腦發(fā)育、心血管健康、炎癥治療等都具有重要作用[6-9]，但α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，不能在人體內(nèi)合成，只能通過(guò)食物攝取。豆油、花生油等常見(jiàn)植物食用油中的主要脂肪酸為油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸[10-11]，α-亞麻酸含量極低，而沙棘中高積累20.3%～36.3%的α-亞麻酸[12]，并且沙棘作為耐旱木本植物可以在沙地、荒山、鹽堿地等邊際土地生長(zhǎng)，可避免與大田油料作物爭(zhēng)奪土地，是理想的α-亞麻酸供給對(duì)象。

目前，油料作物脂肪酸合成途徑及調(diào)控基因的研究較多，在沙棘的相關(guān)研究中多圍繞脂肪酸組分及脂肪酸測(cè)定方法展開(kāi)，少有針對(duì)沙棘中α-亞麻酸合成機(jī)制的研究。本研究選取α-亞麻酸含量存在差異的2個(gè)沙棘品種種子，對(duì)其含量差異及相關(guān)基因進(jìn)行分析，在基因表達(dá)水平上研究沙棘中α-亞麻酸合成及代謝規(guī)律，為培育高α-亞麻酸含量的沙棘良種奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

沙棘種子采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心（內(nèi)蒙古磴口縣），2個(gè)沙棘品種——蒙古大果沙棘向陽(yáng)（Hippophae rhamnoides‘Mongolia’）（XY）和中國(guó)沙棘豐寧（H. rhamnoides‘Sinensis’）（FN）的種子分別采自3個(gè)不同的發(fā)育時(shí)期，依次為未成熟期（T1）、半成熟期(T2)和成熟期(T3)，在這3個(gè)時(shí)期沙棘種子的種皮顏色依次呈現(xiàn)為白色、黑白相間斑點(diǎn)色、黑色。因沙棘種皮與果皮的轉(zhuǎn)色期基本一致，為保證時(shí)期界定更加精準(zhǔn)，同時(shí)利用色差計(jì)測(cè)量沙棘果皮的紅綠色指標(biāo) a 值和黃藍(lán)指標(biāo) b 值，計(jì)算色澤比（h=a/b），種皮呈白色且果皮h值介于-0.18～-0.10的界定為T(mén)1時(shí)期，種皮呈黑白相間斑點(diǎn)色且果皮h值介于0.20～0.28的界定為T(mén)2時(shí)期，種皮呈黑色且果皮h值介于0.52～0.60的界定為T(mén)3時(shí)期。沙棘果實(shí)采集后快速將種子從果實(shí)中剝離，放入液氮中進(jìn)行速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長(zhǎng)久保存，用于下一步分析。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 脂肪酸提取

將樣品冰上解凍，取50 mg樣品于2 mL離心管中。加入1 mL的氯仿甲醇(2:1 v/v)溶液，超聲30 min。取上清液，加入1%硫酸甲醇溶液2 mL，80℃水浴，甲酯化30 min，隨后加入1 mL的正己烷萃取，5 mL的純水洗滌。吸取上清液500 μL，加入25 μL的水楊酸甲酯（500 mg·L-1）作為內(nèi)標(biāo)，混勻加入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣量1 μL，分流比 10∶1，分流進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)。

2.2 色譜-質(zhì)譜分析

樣品采用 AgilentDB-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mmID×0.25 μm)氣相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。程序升溫：初始溫度為 50℃，保持 3 min，隨后以10℃·min-1的速度升溫至220℃并維持 20 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1。樣本隊(duì)列中每間隔6個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)置1個(gè)QC樣本，用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性。采用 Agilent7890A/5975C 氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)樣口溫度280℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃。電子轟擊電離（EI）源，SIM 掃描方式，電子能量70 eV。采用 MSDChemStation 軟件提取色譜峰面積及保留時(shí)間。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中中長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

按照Qingen（Qingen，DE）試劑盒[13]操作說(shuō)明對(duì)樣品中的總RNA進(jìn)行提取，并去除總RNA中DNA片段的殘留。分別使用NanoPhotometer分光光度儀、Qbuit 2.0 熒光計(jì)和Qubit RNA 檢測(cè)試劑盒以及Agilent 2100和RNA Nano 6000試劑盒檢測(cè)RNA純度、RNA濃度以及RNA完整性。RNA檢測(cè)合格后進(jìn)行文庫(kù)制備。使用Illumina HiSeq 2000 對(duì)RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)。為了保證測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Clean data），用于后續(xù)生物信息分析。首先使用DESeq R（1.18.0）[14]進(jìn)行基因表達(dá)量分析，篩選差異表達(dá)基因，然后通過(guò)GOseq R數(shù)據(jù)包[15]和KOBAS（2.0）[16]分別對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩個(gè)沙棘品種種子中脂肪酸組分差異分析

利用氣相色譜分析，在2個(gè)品種沙棘的種子中共檢測(cè)到27種脂肪酸（表1），其中，主要脂肪酸為C18:3N3(α-亞麻酸)、C18:2(亞油酸)、C16:0(棕櫚酸)、C18:1(油酸)、C18:0(硬脂酸)。隨著果實(shí)不斷成熟，2個(gè)品種沙棘種子中，5種主要脂肪酸的含量均逐漸增加，其中，α-亞麻酸和亞油酸含量上升幅度較大。

從圖1可以看出：XY與FN的5種主要脂肪酸的含量均在T2時(shí)期表現(xiàn)出顯著差異。按照脂肪酸含量從大到小排序，在XY中，依次為α-亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸，含量最高的脂肪酸為α-亞麻酸，亞油酸次之；而在FN中，脂肪酸從大到小排序依次為亞油酸、α-亞麻酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸，亞油酸大于α-亞麻酸含量（圖1）。

在T2時(shí)期，2個(gè)沙棘品種種子中α-亞麻酸與亞油酸的比值（α-亞麻酸/亞油酸）存在顯著差異（P＜0.05）。XY中，T2時(shí)期3個(gè)樣本的α-亞麻酸/亞油酸比值分別為1.21、1.17、1.16，而FN分別為0.92、0.75、0.92（表2）。

3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析探究沙棘種子α-亞麻酸的合成規(guī)律

以XY與FN種子的3個(gè)發(fā)育時(shí)期、每個(gè)發(fā)育時(shí)期3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的18個(gè)樣品為材料，通過(guò)RNAseq測(cè)序分析共產(chǎn)生140 G clean data，933 483 428條高質(zhì)量序列(Clean reads)(Q20＞97%;Q30＞93%)，其中，81.5%的序列唯一比對(duì)到參考基因組上。對(duì)2個(gè)品種3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期及相同時(shí)期不同品種間的表達(dá)基因進(jìn)行差異分析，共鑒定出24 917個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）。從圖2A樣本DEGs的主成分分析(PCA)可以看出：2個(gè)沙棘品種各個(gè)時(shí)期生物學(xué)重復(fù)聚類(lèi)效果良好，不同時(shí)期之間與不同品種之間數(shù)據(jù)離散效果良好。通過(guò)DEGs的分布圖(圖2B)可以看出：在T1-T3的發(fā)育過(guò)程中，在T2時(shí)期XY與FN之間的DEGs最多。

表1 XY與FN 2個(gè)沙棘品種種子在不同發(fā)育時(shí)期脂肪酸含量的動(dòng)態(tài)變化Table 1 Dynamic changes of fatty acid composition in the seeds of XY and FN at different developmental stages μg·g-1

依據(jù)序列同源性將24 917個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋?zhuān)? 605個(gè)基因注釋為生物過(guò)程（Biological process），554個(gè)基因注釋為細(xì)胞組成（Cellular component），1 354個(gè)基因注釋為分子功能（Molecular function）。為了進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能和相互作用，使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因進(jìn)行通路富集分析。24 917個(gè)DEGs注釋到122個(gè)KEGG通路，其中，有94個(gè)DEGs的功能富集于脂肪酸合成（Fatty acid biosynthesis）通路、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）通路、α-亞麻酸代謝（α-Linolenicacid metabolism）通路和亞油酸代謝（Linoleicacid metabolism）通路。

圖1 沙棘XY與FN種子中主要脂肪酸組分的含量變化Fig. 1 Distribution of main fatty acid components in XY and FN seeds of sea buckthorn

表2 T2時(shí)期XY與FN種子中的C18:3N3/C18:2Table 2 C18:3n3 / C18:2 in XY and FN seeds of sea buckthorn at T2

圖2 主成分分析與差異表達(dá)基因上調(diào)和下調(diào)分布情況Fig. 2 PCA and up-regulated and down-regulated distribution of DEGs

圖3 沙棘種子發(fā)育過(guò)程中與α-亞麻酸合成相關(guān)的基因表達(dá)模式Fig. 3 Gene expression profiles of Alpha linolenic acid biosynthetic genes during seed development of sea buckthorn

3.3 α-亞麻酸合成與代謝相關(guān)基因表達(dá)分析

T2時(shí)期，基因FAD2在2個(gè)沙棘品種中的表達(dá)量差異顯著（圖3），在XY中的表達(dá)量顯著高于FN，是FN的3.83倍，為α-亞麻酸（C18:3N3）的合成提供充足底物。FAD2基因在XY和FN中表達(dá)量均為先上升后下降，在第2時(shí)期表達(dá)量急劇上升達(dá)到峰值，與XY和FN中的亞油酸（C18:2）含量在第二時(shí)期顯著增加（圖1）相一致。

基因FAD3和基因FAD7調(diào)控亞麻酸生成α-亞麻酸（圖4），在FN中的整體表達(dá)水平遠(yuǎn)低于XY，與XY中α-亞麻酸含量高于FN（圖1）的結(jié)果相一致?；騀AD3在FN種子中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，在XY種子中的表達(dá)水平先急劇上升，在T2時(shí)期達(dá)到峰值，后在T3時(shí)期表達(dá)量下調(diào)；T1時(shí)期，基因FAD3在XY中的表達(dá)量是FN 中的2.02倍，T2時(shí)期基因FAD3在XY和FN中的表達(dá)差異顯著，在XY中的表達(dá)量是FN中的13.63倍（圖3）?；騀AD7在XY和FN中的表達(dá)趨勢(shì)均為先上升后下降，T1和T2時(shí)期在XY中的表達(dá)量顯著高于在FN中的表達(dá)量，T1時(shí)期在XY中的表達(dá)量是FN 中的2.09倍，T2時(shí)期在XY中的表達(dá)量是FN 中的1.72倍（圖3）。

基因LOX調(diào)控α-亞麻酸氧化（圖4），生成脂肪酸氫過(guò)氧化物，是調(diào)控α-亞麻酸轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的第一步，基因LOX3.1在XY和FN種子的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)趨勢(shì)均為逐漸下降，在FN中的表達(dá)量高于XY，T1時(shí)期基因LOX3.1在FN中的表達(dá)量是XY中的3.58倍，T2時(shí)期基因LOX3.1在FN中的表達(dá)量是XY中的8.02倍（圖3）。基因LOX3.2在FN中的表達(dá)量同樣高于XY，T1時(shí)期在FN中的表達(dá)量是XY中的3.24倍，T2時(shí)期在FN中的表達(dá)量是XY中的7.12倍（圖3）。基因LOX的高表達(dá)不利于α-亞麻酸的積累，與圖1中所顯示的XY中α-亞麻酸含量高于FN的結(jié)果相一致。

4 討論

沙棘種子中富含不飽和脂肪酸，其中，α-亞麻酸含量一般較高。α-亞麻酸作為人體必需脂肪酸，具有多種有益的生理功能，因此，為了進(jìn)一步提高沙棘種子中α-亞麻酸含量，培育沙棘新品種和良種，在分子水平上研究沙棘中α-亞麻酸的合成代謝規(guī)律至關(guān)重要。亞油酸是α-亞麻酸合成的底物，脫飽和生成亞麻酸[17-18]。本研究選取的2個(gè)沙棘品種中，α-亞麻酸/亞麻酸的比值存在顯著差異，XY種子中α-亞麻酸是含量最高的脂肪酸，亞油酸含量次之，而在FN中正相反，含量最高的脂肪酸是亞油酸，α-亞麻酸含量次之。因此，基于這2個(gè)品種存在的差異挖掘沙棘種子中調(diào)控亞油酸向α-亞麻酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因以及抑制α-亞麻酸分解的關(guān)鍵基因，探究α-亞麻酸合成代謝規(guī)律。

FAD2催化油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸[19-21]，F(xiàn)AD2基因表達(dá)量下降使亞油酸合成受阻，進(jìn)而影響α-亞麻酸的生成，而FAD2基因的高表達(dá)可以為α-亞麻酸的合成提供充足的底物。2個(gè)沙棘品種種子中的亞油酸含量在T2時(shí)期快速積累，與T2時(shí)期基因FAD2的表達(dá)水平急劇上升相一致。在XY和FN種子中，T1和T2時(shí)期之間的亞油酸含量差異顯著。T3時(shí)期基因FAD2的表達(dá)量降低，亞油酸含量積累速度明顯下降。

α-亞麻酸在FAD3和FAD7的催化下由亞油酸脫飽和產(chǎn)生[17-18]。FAD3與FAD7同屬于ω-6 型脂肪酸去飽和酶，已有的研究表明，基因FAD3在植物種子α-亞麻酸的合成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[22-24]。實(shí)驗(yàn)表明，擬南芥的FAD3基因在大豆中異位表達(dá)可使大豆中α-亞麻酸含量增加，大豆的FAD3C基因在芝麻中特異性表達(dá)同樣也可使芝麻中α-亞麻酸的含量顯著提高[25]。此外，Wu等將麻風(fēng)樹(shù)的JcFAD3基因在擬南芥的種子中特異性表達(dá)使擬南芥種子中α-亞麻酸的含量提高了20.50%～24.94%；同時(shí)亞油酸的含量相比野生型降低了11.4%～23.5%[26]。在煙草中過(guò)表達(dá)擬南芥FAD7基因，同樣使煙草中α-亞麻酸的含量升高且亞油酸含量下降[23]。

在T1和T2時(shí)期，XY中基因FAD3和基因FAD7的表達(dá)量遠(yuǎn)高于FN，尤其在T2時(shí)期，基因FAD3在XY和FN中的表達(dá)差異顯著，在XY中的表達(dá)量是FN中的13.63倍，調(diào)控大量亞油酸脫飽和生成α-亞麻酸，因此，XY種子中α-亞麻酸的含量大于亞油酸的含量，而FN中亞油酸含量比α-亞麻酸高。這解釋了為何基因FAD2在XY種子中的表達(dá)量高于FN，但亞油酸含量卻是FN種子大于XY種子。

基因LOX是α-亞麻酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵基因，是調(diào)控α-亞麻酸轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的第一步，調(diào)控α-亞麻酸氧化，生成脂肪酸氫過(guò)氧化物[27-29]?；騆OX3.1和基因LOX3.2在XY和FN發(fā)育的T1時(shí)期表達(dá)量處于3個(gè)時(shí)期的最大值，抑制α-亞麻酸的積累，協(xié)同基因FAD2、FAD3、FAD7在T1時(shí)期的低表達(dá)水平，導(dǎo)致T1時(shí)期α-亞麻酸含量處于低水平，T2時(shí)期基因LOX3.1和LOX3.2表達(dá)量下調(diào)，基因FAD2、FAD3、FAD7表達(dá)量急劇上升，因而α-亞麻酸含量在T2時(shí)期顯著增長(zhǎng)。同時(shí)，基因LOX3.1和LOX3.2在FN種子中的表達(dá)量高于XY種子，抑制FN種子中α-亞麻酸的積累，使FN種子中α-亞麻酸積累量低于XY。

沙棘種子中α-亞麻酸的高積累源于多個(gè)基因的協(xié)同調(diào)控作用，基因FAD2、FAD3、FAD7的高表達(dá)協(xié)同基因LOX3.1和LOX3.2的低表達(dá)使α-亞麻酸的高積累得以實(shí)現(xiàn)。

本研究在基因和代謝水平上研究沙棘中α-亞麻酸合成代謝規(guī)律，對(duì)進(jìn)一步提高沙棘種子中α-亞麻酸含量、培育沙棘良種具有重要意義。

圖4 與α-亞麻酸生物合成與代謝相關(guān)的途徑Fig. 4 Pathway related to the biosynthesis and metabolism of α-linolenic acid

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)2個(gè)不同沙棘品種種子中中長(zhǎng)鏈脂肪酸和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析得出：沙棘種子中α-亞麻酸的高積累源于多個(gè)基因的協(xié)同調(diào)控作用?；騀AD2調(diào)控油酸去飽和生成亞油酸，其高表達(dá)為α-亞麻酸的合成提供了充足的底物。α-亞麻酸在基因FAD3和基因FAD7的調(diào)控下由亞油酸去飽和產(chǎn)生，基因FAD3和基因FAD7的高表達(dá)促進(jìn)亞油酸向α-亞麻酸轉(zhuǎn)化，使α-亞麻酸積累，同時(shí)使亞油酸含量下降。沙棘種子中基因LOX3.1和LOX3.2是α-亞麻酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平下降有利于種子中α-亞麻酸的積累。