電針對(duì)炎性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞活化和P2X7 受體表達(dá)的干預(yù)

周游,汪雯,蔡楊乾,杜俊英,邵曉梅,蔣永亮,劉伯一,高宏,梁宜,,方劍喬,2

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院針灸神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310053; 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院針灸科, 杭州 310053)

隨著生活水平的不斷提升,人們對(duì)生活質(zhì)量的要求日益提高,而慢性疼痛是損害患者生活質(zhì)量的重要因素之一。 有報(bào)道顯示：去年,發(fā)達(dá)國(guó)家中的慢性疼痛患者人數(shù)達(dá)到人口總數(shù)的37.3%,而發(fā)展中國(guó)家則高達(dá)41.1%[1]。 最新報(bào)道顯示美國(guó)慢性疼痛的發(fā)病率高達(dá)4.8%[2],中國(guó)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示女性慢性疼痛發(fā)生率高于男性(女性：39.92%,男性：32.17%)[3]。 慢性疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給個(gè)人和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。 炎性疼痛是慢性疼痛的主要類(lèi)型之一,目前主要采用非甾體類(lèi)抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)進(jìn)行治療[4]。 雖然 NSAIDs 抗炎鎮(zhèn)痛療效顯著,但因胃腸道損傷、心血管損害等副作用而限制其臨床應(yīng)用。 電針療法作為新型針刺療法,因其鎮(zhèn)痛療效確切被廣泛應(yīng)用于臨床鎮(zhèn)痛[5]。

嘌呤 P2X7 受體(purinergic P2X7 receptor,P2X7R)是三磷酸腺苷敏感的配體門(mén)控陽(yáng)離子通道的受體,在外周選擇性表達(dá)于衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞[6-7],新近研究表明P2X7R 在疼痛信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用[8-11]。 課題組前期研究已證實(shí)電針有較好抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)[12-14],電針抗炎性痛效應(yīng)是否與抑制外周衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞活化及其P2X7R 表達(dá)相關(guān),暫未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 故本研究通過(guò)觀察電針對(duì)炎性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞活化與P2X7R 表達(dá)的干預(yù),以期揭示電針抗炎性痛的部分外周調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雄性 SD 大鼠 86 只,6 周齡,體重(180 ± 20) g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(滬)2018 - 0006】,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)【SYXK(浙)2018-0012】,本實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)期間給予嚙齒類(lèi)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)及自由飲水,12 h 循環(huán)燈光,恒定濕度,室溫(23 ± 2)℃。 本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求,倫理審批號(hào)： IACUC-20190715-03。

1.1.2 試劑與儀器

完全弗氏佐劑(F5881,美國(guó) Sigma),兔抗P2X7R(APR-004,美國(guó) Alomone),GAPDH(3683,美國(guó)CST),兔抗GFAP(ab7260,美國(guó)Abcam),山羊抗兔IgG H&L(ab6721,美國(guó) Abcam),P2X7R 選擇性抑制劑A740003(3701,美國(guó)Tocris),P2X7R 選擇性激動(dòng)劑 BzATP(B6396,美國(guó) Sigma),BCA 試劑盒(P0010,中國(guó)碧云天),ECL 試劑盒(P0018,中國(guó)碧云天)。

纖毛機(jī)械刺激針(NC12775, 美國(guó) Stoelting Co.);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200 A,中國(guó)聯(lián)創(chuàng)科技公司);一次性無(wú)菌針灸針(0.25 × 13 mm,中國(guó)蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);恒溫手術(shù)臺(tái)(美國(guó)Harvard);動(dòng)物麻醉機(jī)(WMR,美國(guó) MATRX);超聲波粉碎機(jī)(中國(guó)寧波新芝生物科技有限公司);電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)BioRad);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sorvall Biofuge Stratos,美國(guó) Thermo Scientific);酶標(biāo)儀(SpectraMax M4,美國(guó)Molecular Devices);凝膠成像系統(tǒng)(Image Quant LAS4000,德國(guó)GE)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模

每只大鼠右后足掌面正中皮下注射完全弗氏佐劑(complete freud’s adjuvant,CFA)0.1 mL,建立大鼠炎性痛模型;對(duì)照大鼠僅在相同位置注射相同劑量的0.9%生理鹽水溶液。

1.2.2 鞘內(nèi)置管術(shù)

使實(shí)驗(yàn)第二部分大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d 后,于模前8 d進(jìn)行鞘內(nèi)置管術(shù)。 具體方法如下：采用異氟烷(輸出濃度為2%)以500 mL/min 氧氣流量進(jìn)行低流量吸入麻醉。 將大鼠背部L6-S1 區(qū)域常規(guī)去毛備皮。 于大鼠L6-S1 棘突中間縱向做切口,分離肌肉與棘間韌帶,用咬骨鉗去除L6 部分棘突,形成“V”形切口,暴露椎間隙。 用導(dǎo)引針頭刺穿硬脊膜,隨后將PE-10 導(dǎo)管從穿刺部位斜向上緩慢插入,使其到達(dá)L4-L5 間隙。 經(jīng)皮下隧道將導(dǎo)管另一端于頸部引出,前端保留4 ～6 cm,熱熔封閉管的外端口。 置管術(shù)后肌肉注射青霉素并單籠飼養(yǎng)。 術(shù)后待大鼠活動(dòng)自如后,注入10 μL 的2%利多卡因及25 μL 生理鹽水。 鞘內(nèi)注射后30 s 內(nèi)大鼠出現(xiàn)雙下肢麻痹,拖地、不能負(fù)重,鉗夾或針刺不產(chǎn)生縮足反應(yīng),待藥效消退后可完全恢復(fù)正常肢體活動(dòng)能力,以此驗(yàn)證鞘內(nèi)置管成功,否則為失敗。

1.2.3 分組與處理

第一部分：48 只大鼠完全隨機(jī)分為4 組：空白組(Con 組,n=12)、炎性痛組(CFA 組,n=12)、炎性痛 + 電針組(CFA + EA 組,n=12)、炎性痛+假電針組(CFA + sEA 組,n=12)。 除了 Con 組,余三組大鼠均接受造模和與CFA + EA 組相同固定處理。CFA + EA 組于造模后第8 天介入電針治療,采用0.25 mm × 13 mm 針灸針刺入大鼠雙側(cè)“足三里”、“昆侖”,連接HANS-200 A 韓氏電針儀,刺激參數(shù)選用疏密波、頻率2/100 Hz、強(qiáng)度為0.5-1-1.5 mA(每10 min 步進(jìn)0.5 mA),每次治療30 min,每日1次,連續(xù)7 d;CFA + sEA 組僅將針灸針刺入相同穴位皮下不予通電。

第二部分：鞘內(nèi)置管術(shù)成功的38 只大鼠隨機(jī)分為炎性痛 + DMSO 組(CFA + DMSO 組,n=8)、炎性痛 + A740003 組(CFA + A740003 組,n=10)、炎性痛+電針+生理鹽水組(CFA + EA + NS 組,n=8)和炎性痛+電針 + BzATP 組(CFA + EA + BzATP 組,n=12),于造模后第12 ～14 天分別鞘內(nèi)注射10 μL不同藥物(0.1% DMSO 溶液、250 nmol/L A740003溶液、滅菌生理鹽水和280 nmol/L BzATP 溶液),每日1 次,連續(xù) 3 d。 考慮到留置 PE 管體積,每次鞘內(nèi)給藥后給予25 μL 滅菌生理鹽水沖管后再行封管。 CFA + EA + NS 組和 CFA + EA + BzATP 組鞘內(nèi)給藥前給予電針治療,具體參數(shù)同第一部分,共治療7 次。

1.2.4 痛行為檢測(cè)

采用縮腿閾(paw withdrawal threshold,PWT)作為大鼠痛行為觀測(cè)指標(biāo),分別于CFA 造模前后、電針治療和鞘內(nèi)給藥前后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)PWT。 正式測(cè)定前將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)(20 cm × 20 cm × 15 cm),使其適應(yīng)環(huán)境 30 min。待大鼠停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng),選用不同Von Frey 絲(0.4、0.6、1、2、4、6、8、15、26 g)垂直刺激大鼠右后足底中部,向大鼠足墊施加壓力至Von Frey絲輕微彎曲并持續(xù)5 s。 若大鼠出現(xiàn)縮腿或舔足反應(yīng)則為陽(yáng)性反應(yīng),記為“X”并給予相鄰小一級(jí)力度的刺激。 當(dāng)該力度的von Frey 纖維刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),則記為“O”并給予相鄰大一級(jí)力度的纖維刺激,每次刺激間隔30 s。 由此可得到一串以“O”或“X”組合的序列,并使用 Chaplan 等[15]描述的方法進(jìn)行計(jì)算。 若計(jì)算得出50% PWTs ＞26.0 g或＜0.4 g,仍以26.0 g 或0.4 g 作為最大或最小值。

1.2.5 取材及樣本處理

本實(shí)驗(yàn)于CFA 模后14 d 檢測(cè)完P(guān)WT 后,進(jìn)行取材。 用3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,暴露心臟,左心室、升主動(dòng)脈用 4℃預(yù)冷的生理鹽水快速灌注,快速取出患側(cè)L4-6 DRG,置入-80℃冰箱中保存。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)大鼠DRG 中GFAP、P2X7R蛋白表達(dá)

將大鼠患側(cè)L4-6 背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)使用 RIPA 裂解液提取總蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白濃度后,進(jìn)行蛋白變性。 上樣時(shí)采用8%分離膠、5%濃縮膠制膠,電泳后轉(zhuǎn)印致PVDF 膜。 使用5% 脫脂奶粉封閉,分別用 TBST稀釋好的一抗：兔抗 P2X7R(1 ∶1000,Alomone),兔抗 GFAP (1 ∶2000,Abcam),GAPDH(1 ∶1000,CST),4℃孵育過(guò)夜。 隨后加入TBST 稀釋的二抗：山羊抗兔IgG H&L(1 ∶10000,Abcam),室溫?cái)噭?dòng)孵育2 h。 使用ECL 發(fā)光試劑盒顯色拍片。 采用德國(guó)GE 公司凝膠成像系統(tǒng)ImageQuant LAS 4000 進(jìn)行成像,拍片后使用Image J 軟件計(jì)算條帶的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤( ˉx ± sˉx)表示,采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 兩組組間采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,多組間不同時(shí)間點(diǎn)采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析。兩兩比較方差齊性時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)、方差不齊時(shí)采用 Dunnett’s T3 檢驗(yàn);均以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PWTs 變化

如圖1 所示,造模前各組大鼠患側(cè)基礎(chǔ)PWTs無(wú)差異(P＞0.05)。 與Con 組比較,余三組大鼠造模后 1、3、7 d 時(shí) PWTs 顯著降低(P＜ 0.01);模后第8 天介入電針治療,每次電針治療后30 min 內(nèi)完成PWTs 測(cè)量。 單次電針治療后,CFA + EA 組大鼠患側(cè)PWTs 并未出現(xiàn)顯著變化(P＞0.05)。 電針治療3、5、7 次后,CFA + EA 組大鼠患側(cè) PWTs 逐漸遞增,顯著高于同期CFA 和CFA + sEA 組(P＜0.05或P＜0.01),但仍低于同期Con 組(P＜0.01)。 結(jié)果提示重復(fù)電針治療可有效緩解CFA 誘發(fā)的慢性炎性痛。

2.2 各組大鼠L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表達(dá)變化

如圖2 所示,造模后14 d 時(shí),CFA 大鼠患側(cè)L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表達(dá)顯著高于同期Con 組(P＜0.05);CFA + EA 組大鼠患側(cè) L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表達(dá)顯著低于同期CFA 組和CFA + sEA(P＜0.05),與同期Con 組無(wú)明顯差異(P＞0.05);而CFA + sEA 組與同期CFA 組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)果表明電針可顯著降低CFA 大鼠患側(cè)DRG 中GFAP 蛋白表達(dá),提示電針可抑制外周衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞活化。

2.3 各組大鼠 L4-6 DRG 中 P2X7R 蛋白表達(dá)變化

如圖3 所示,于造模后14 d,CFA 組大鼠患側(cè)L4-6 DRG 中P2X7 蛋白表達(dá)顯著高于同期Con 組(P＜ 0.05);與同期CFA 組比較,CFA + sEA 組大鼠患側(cè) DRG 中 P2X7 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P ＞0.05);CFA + EA 組大鼠患側(cè)DRG 中P2X7 蛋白表達(dá)顯著低于同期 CFA 和 CFA + sEA 組(均 P ＜0.05)。 結(jié)果表明電針可顯著抑制CFA 大鼠患側(cè)DRG 中 P2X7R 表達(dá)。

2.4 鞘內(nèi)注射P2X7R 選擇性抑制劑A740003 提高炎性痛大鼠機(jī)械痛閾

如圖4 所示,實(shí)驗(yàn)大鼠接受鞘內(nèi)置管術(shù)后予以修復(fù)1 周,分別于模前8 d、模前1 d 檢測(cè)兩組大鼠基礎(chǔ)PWTs 情況,兩組間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。兩組大鼠經(jīng)由相同造模處理,模后兩組痛閾均無(wú)差異(P＞0.05)。 實(shí)驗(yàn)大鼠于造模后12 ～14 d 分別鞘內(nèi)注射A740003 或等量0.1% DMSO 溶液,CFA +A740003 組大鼠患側(cè) PWTs 顯著高于同期 CFA+DMSO 組(均P＜0.01)。 結(jié)果提示鞘內(nèi)給藥P2X7R選擇性抑制劑可拮抗CFA 大鼠痛覺(jué)異常。

2.5 鞘內(nèi)注射P2X7R 激動(dòng)劑BzATP 翻轉(zhuǎn)電針抗炎性痛效應(yīng)

如圖5 所示,實(shí)驗(yàn)大鼠接受鞘內(nèi)置管術(shù)后予以修復(fù)1 周,分別于模前8 d、模前1 d 檢測(cè)兩組大鼠基礎(chǔ)PWTs 情況,兩組間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。兩組大鼠經(jīng)由相同造模處理,模后兩組痛閾均無(wú)差異(P＞0.05)。 兩組大鼠于造模后8 ～11 d 均接收電針治療,組間無(wú)差異(P＞0.05);于造模后12 ～14 d 各時(shí)點(diǎn),CFA + EA + BzATP 組大鼠患側(cè)足跖PWTs 顯著低于同期 CFA + EA + NS 組(均 P ＜0.01)。 結(jié)果提示鞘內(nèi)注射 P2X7R 激動(dòng)劑 BzATP可翻轉(zhuǎn)EA 對(duì)CFA 大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

圖2 各組大鼠L4-6 DRG 中GFAP 蛋白表達(dá)變化Figure 2 Changes of GFAP protein expression in L4-6 DRG among groups of rats

圖3 各組大鼠L4-6 DRG 中P2X7R 蛋白表達(dá)變化Figure 3 Changes of P2X7R protein expression in L4-6 DRG among groups of rats

注：A： 實(shí)驗(yàn)流程圖;B： 與 CFA+DMSO 組比較,*P＜ 0.05,**P＜ 0.01。圖4 鞘內(nèi)給藥P2X7R 抑制劑A740003 提高CFA 大鼠患側(cè)PWTsNote. A, Illustration of experimental design. B, Compared with CFA + DMSO group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 4 Intrathecal injection of selective P2X7R inhibitor A740003 increased ipsilateral PWTs of CFA rats

注：A：本實(shí)驗(yàn)流程及PWTs 測(cè)量時(shí)點(diǎn)示意圖。 B：與CFA + EA + NS 組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。圖5 鞘內(nèi)給藥P2X7R 激動(dòng)劑BzATP 翻轉(zhuǎn)電針對(duì)CFA 大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)Note. A, Experiment process and timing of PWTs measurement. B, Compared with CFA + EA + NS group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 5 Intrathecal injection of selective P2X7R agonist BzATP reversed EA’s analgesia on CFA rats

3 討論

電針療法是傳統(tǒng)針刺療法與微量電流刺激相結(jié)合的一種新型療法。 最早于二十世紀(jì)五十年代由朱玉龍醫(yī)生首次提出,用于替代臨床針灸醫(yī)師繁瑣的運(yùn)針過(guò)程。 現(xiàn)代研究表明,電針是臨床鎮(zhèn)痛的常用針灸方法,具有綠色、副作用小,臨床上易于推廣等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于治療炎性痛、神經(jīng)病理性疼痛等各類(lèi)疼痛。 有臨床觀察研究結(jié)果表明電針鎮(zhèn)痛取穴雙側(cè)肢體較單側(cè)(患側(cè))療效顯著[16]。 課題組既往實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明,雙側(cè)電針穴位“昆侖”、“足三里”能有效緩解大鼠炎性痛[17]。 既往研究表明,CFA 致炎性痛大鼠模型于造模后4 ～24 h 處于急性期,1 ～3 d 處于亞急性期,3 d 后轉(zhuǎn)向慢性痛[18]。 本研究前期實(shí)驗(yàn)表明,CFA 致炎性痛模型于模后1 d 出現(xiàn)患側(cè)PWTs 顯著下降,并持續(xù)維持較低痛閾至模后42 d。 模后28 d,對(duì)側(cè)PWTs 顯著降低,出現(xiàn)“鏡像痛”并維持至模后42 d。 同時(shí),熱痛(thermal withdrawal latency,TWL)在模后1 d 顯著下降并持續(xù)至14 d。 現(xiàn)有研究表明,通過(guò)在足底內(nèi)注射CFA100 μL 可引起大鼠雙側(cè)機(jī)械性異常性疼痛,及患側(cè)熱痛覺(jué)過(guò)敏。 CFA 致炎性痛患側(cè)PWTs 在模后(＜1 h)迅速下降,在模后7 d 到達(dá)最低峰值,并持續(xù)維持較低痛閾至造模后28 d。 約在模后28 d,對(duì)側(cè)足跖也出現(xiàn)PWTs 降低的情況。 同時(shí),CFA 致炎性痛也可引起 TWL 迅速下降(＜1 h)。 TWL 在模后6 h 達(dá)到峰值,于模后14 ～28 d 可緩慢恢復(fù)致正常水平[18-19]。 本研究中機(jī)械痛、熱痛變化趨勢(shì)與現(xiàn)有文獻(xiàn)一致[18-19],說(shuō)明造模成功。 Gao 等[19]通過(guò)鞘內(nèi)注射選擇性JNK 抑制劑,發(fā)現(xiàn)可降低CFA 致慢性炎性痛維持階段的機(jī)械痛,但對(duì)其引起的熱痛沒(méi)有影響。 Lao 等[20]也指出,腹腔注射納洛酮(20 mg/kg)可逆轉(zhuǎn)單次電針對(duì)CFA 致炎性痛產(chǎn)生的機(jī)械痛閾下降。 以上結(jié)果提示兩者(熱痛與機(jī)械痛)機(jī)制有所差別,在慢性炎性痛的維持階段,機(jī)械痛變化較之熱痛更具變化特點(diǎn)。 由于本研究處于慢性炎性痛維持期,因此側(cè)重機(jī)械痛的變化情況作為行為學(xué)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。 據(jù)研究表明,電針對(duì)CFA 致炎性痛大鼠患側(cè)PWTs、TWL 均具有升高作用[21-22],并且電針治療在辣椒素、角叉菜膠及CFA 等不同藥物誘導(dǎo)的炎性痛模型均有效果[23]。 這與實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果[24-25]相一致,提示電針治療炎性痛效果確切。本研究中觀察到連續(xù)7 d 電針治療可升高CFA 致炎性痛大鼠患側(cè)PWTs 至模后14 d,提示電針可以有效對(duì)抗炎性疼痛,與課題組以往研究結(jié)果相符[17,23-24]。 但本研究并未觀察到單次電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng),可能與炎性痛大鼠在足底注射CFA 后24 h 時(shí)足部腫脹嚴(yán)重,導(dǎo)致大鼠縮足反應(yīng)性降低所致,提示重復(fù)電針可有效緩解慢性炎性痛,而在炎性痛急性期治療并不占優(yōu)勢(shì)。

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)是初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的聚集地,負(fù)責(zé)將外周感覺(jué)信號(hào)傳輸至中樞神經(jīng)系統(tǒng);外周損傷引起的DRG 神經(jīng)元胞體誘發(fā)出持續(xù)性的自發(fā)異位放電,常被認(rèn)為傳入脊髓后可增強(qiáng)外周信號(hào)和激發(fā)放大效應(yīng)[25]。 衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(satellite glial cells,SGCs)分布在DRG 神經(jīng)元胞體周?chē)?SGCs 活化可調(diào)控DRG 神經(jīng)元興奮性參與外周痛覺(jué)敏化的調(diào)控。 膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)被認(rèn)為是中樞星型膠質(zhì)細(xì)胞和外周衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物。炎癥、神經(jīng)損傷等病理狀態(tài)下SGCs 可被激活,主要表現(xiàn)為GFAP 表達(dá)增加[26-27]。 本研究觀察到CFA大鼠造模后14 d 患側(cè)L4-6 DRG 中GFAP 表達(dá)顯著增高。 以往研究中在不同疼痛模型的不同時(shí)點(diǎn)也觀察到與本研究類(lèi)似結(jié)果。 Liu 等[28]在脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)致神經(jīng)病理性疼痛模型中,觀察到SNL 大鼠于術(shù)后4 h 便觀察到DRG 中GFAP 表達(dá)增加,并持續(xù)高水平表達(dá)至術(shù)后7 d。 Nascimento 等[29]研究表明,在CFA 致炎性痛模型中背根神經(jīng)節(jié)GFAP 表達(dá)顯著升高,造模后7 d 到達(dá)表達(dá)高峰并維持高水平至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 課題組以往研究結(jié)果顯示,電針可抑制SNL 大鼠脊髓背角GFAP 表達(dá),提示電針鎮(zhèn)痛與其抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)[13]。 本研究中,我們觀察到電針可顯著抑制大鼠足底注射CFA 引起的DRG 中GFAP 表達(dá)升高,提示背根神經(jīng)節(jié) SGCs 活化參與CFA 誘發(fā)炎性痛,抑制SGCs 活化介導(dǎo)電針抗大鼠炎性痛效應(yīng)。

近來(lái)研究表明,P2X7 受體在疼痛的發(fā)展和維持中擔(dān)當(dāng)重要角色,在炎性痛、神經(jīng)病理性疼痛等多種疼痛狀態(tài)呈表達(dá)上調(diào)[8-11]。 已有研究證實(shí)SGCs 活化與P2X7R 表達(dá)增加成正相關(guān),GFAP 與P2X7R 蛋白表達(dá)在CCI 模型導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下均有升高趨勢(shì)[30];Wu 等[31]發(fā)現(xiàn)在gp120誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中大鼠DRG 內(nèi)P2X7R 和GFAP 的熒光共表達(dá)增加。 在外周神經(jīng)組織中,嘌呤P2X7 受體特異性表達(dá)于SGCs 中,背根神經(jīng)元和SGCs 可以通過(guò)ATP 釋放和P2X7R 激活進(jìn)行細(xì)胞間通信。 以往有研究發(fā)現(xiàn)CFA 大鼠DRG 中P2X7R蛋白表達(dá)顯著升高;敲除P2X7R 基因可消除炎癥誘發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏;于大鼠足跖局部注射P2X7R 非特異性拮抗劑 oxidized ATP (ox ATP) 或鞘內(nèi)注射A740003 可有效緩解不同造模方式導(dǎo)致的炎性疼痛[32-33]。 本研究結(jié)果也觀察到CFA 大鼠患側(cè)DRG中P2X7R 蛋白表達(dá)顯著升高,且鞘內(nèi)注射P2X7R拮抗劑A740003 可有效提高CFA 大鼠縮腿閾進(jìn)而緩解炎性疼痛,與以往研究結(jié)果較一致[32-33]。 關(guān)于EA 是否通過(guò)調(diào)控P2X7R 表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用相關(guān)研究并不多見(jiàn),主要集中于EA 對(duì)中樞脊髓P2X7R 表達(dá)的干預(yù)研究。 以往研究表明,EA 可通過(guò)抑制脊髓P2X7R 陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)而緩解神經(jīng)損傷誘發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏[34];在頸部術(shù)后切口痛模型中,電針可通過(guò)抑制頸髓P2X7R 介導(dǎo)fractalkine/CX3CR1信號(hào)通路活化發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)[35]。 然而,抑制外周P2X7R 表達(dá)是否參與電針鎮(zhèn)痛的相關(guān)性研究,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 本研究觀察到電針可以顯著抑制CFA 大鼠患側(cè)DRG 中P2X7R 蛋白表達(dá),且鞘內(nèi)注射P2X7R 特異性激動(dòng)劑BzATP 可有效翻轉(zhuǎn)電針鎮(zhèn)痛效應(yīng),結(jié)果提示外周P2X7R 參與電針抗炎性痛效應(yīng)。

綜上所述,電針可有效緩解大鼠慢性炎性痛,抑制外周SGCs 及其P2X7R 活化可能是電針抗炎性痛的外周作用機(jī)制之一。