西紅花苷通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用*

邢甜甜，單 偉

1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室(錦州 121001)；2.遼寧省營(yíng)口市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院(營(yíng)口 115007)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)以腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生等為特征，最終引起尿蛋白增加甚至腎功能衰竭[1-5]。Ye等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和炎癥改變對(duì)DN發(fā)展尤為關(guān)鍵。西紅花苷為中藥西紅花的提取物，因其抗炎、抗氧化、抗糖尿病等作用突出而備受關(guān)注[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，老年大鼠腎臟病變時(shí)，可出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥異常，西紅花苷腹腔注射給藥 4 周后血清腎功能指標(biāo)、氧化參數(shù)、炎癥基因表達(dá)水平明顯下降，治療效果較好。然而，西紅花苷對(duì)DN的影響尚不清楚。因此，本研究擬觀察西紅花苷對(duì)DN大鼠腎臟的保護(hù)作用并探討相關(guān)機(jī)制，為研究DN的治療方案拓展思路。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量為200～240 g(購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué))。

1.2 主要試劑和儀器：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)；西紅花苷(批號(hào)：111588-200501)；核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-6(Interleukin-6，IL-6)一抗 (英國(guó)Abcam公司)；HE染色、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒及Western blot二抗；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)SLEE公司)。

2 研究方法

2.1 動(dòng)物分組：取雄性SD大鼠30只，按55 mg/kg一次性腹腔注射STZ，72 h測(cè)血糖，將血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型并隨機(jī)分成糖尿病組和西紅花苷組(30 mg/kg)，每組15只。另取15只正常SD大鼠作為對(duì)照組。每天給藥1次，劑量依據(jù)文獻(xiàn)[9-10]及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。12周后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.2 樣本制備：實(shí)驗(yàn)過程中檢測(cè)大鼠空腹血糖，大鼠處死前取血離心后取上清-20 ℃凍存，待測(cè)血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、尿白蛋白/肌酐比值(Albumin/creatinine ratio，ACR)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)。12周后，每組取5只大鼠，固定后取出腎臟進(jìn)行石蠟切片，用于HE染色及免疫組化。每組另取5只大鼠活取腎臟，裂解后制備上清，-20 ℃保存，用于進(jìn)行Western blot。每組另取5只大鼠活取腎臟制備100 g/L勻漿，-20 ℃保存，用于SOD、CAT、MDA含量檢測(cè)，均采用試劑盒檢測(cè)。

2.3 HE染色：①經(jīng)2.2制備的切片脫蠟后PBS洗3次；②蘇木素浸染2 min，自來水沖洗；③滴加伊紅1 min；④脫水透明后封片，拍照觀察。

2.4 免疫組化染色檢測(cè)大鼠腎臟NF-κB表達(dá)：①2.2制備的切片于PBS洗滌4次；②3% H2O2室溫12 min，PBS洗滌3次；③3%血清室溫下封閉40 min，不洗；④滴加一抗NF-κB(1∶600)，4 ℃過夜， PBS洗滌3次；⑤滴加二抗，室溫30 min，PBS洗滌3次；⑥滴加鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物，室溫下30 min，PBS洗滌3次；⑦DAB顯色后拍照，Image J軟件分析NF-κB表達(dá)陽性率。

2.5 Western blot檢測(cè)NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)：①提取腎臟總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度；②10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以含1% BSA的TBST室溫封閉3 h；③加一抗4 ℃過夜，TBST洗滌5次；④加入HRP標(biāo)記的二抗室溫2 h，TBST洗滌5次；⑤ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值。

結(jié) 果

1 三組大鼠血糖、BUN、ACR、Scr比較 見表1。與對(duì)照組相比，糖尿病組血糖明顯升高(P<0.05)，BUN、ACR和Scr亦明顯升高(P<0.05)。而與糖尿病組相比，西紅花苷組血糖、BUN、ACR和Scr均不同程度下降(均P<0.05)。

表1 三組大鼠血糖、BUN、ACR、Scr比較

2 三組大鼠腎組織HE染色結(jié)果 見圖1。對(duì)照組腎組織形態(tài)規(guī)則。糖尿病組腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球水腫增大。與糖尿病組相比，西紅花苷組上述變化均有所改善。

3 三組大鼠腎臟SOD、CAT、MDA比較 見表2。與對(duì)照組相比，糖尿病組MDA含量明顯升高，SOD、CAT含量明顯降低(P<0.05)。而與糖尿病組相比，西紅花苷組MDA含量明顯降低，SOD、CAT含量明顯升高(P<0.05)。

表2 三組大鼠腎臟SOD、CAT和MDA比較

4 三組大鼠腎臟NF-κB蛋白表達(dá)比較 見表3(圖2)。與對(duì)照組相比，糖尿病組NF-κB表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與糖尿病組相比，西紅花苷組NF-κB表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

5 Western blot檢測(cè)結(jié)果 見表3(圖3)。與對(duì)照組相比，糖尿病組NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與糖尿病組相比，西紅花苷組NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

表3 三組大鼠腎臟NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)比較(%)

圖3 Western blot檢測(cè)NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)

討 論

DN是一種以腎小球系膜和腎間質(zhì)組織損傷為特征的進(jìn)行性、不可逆性腎臟疾病。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為DN發(fā)病的中心因素[11-12]。氧化應(yīng)激失衡時(shí)會(huì)引起腎臟SOD、CAT和MDA含量的改變[13]。SOD對(duì)活性氧的清除只有在CAT的作用下才有效，因?yàn)镃AT可進(jìn)一步清除SOD產(chǎn)生的過氧化氫。這些酶之間的平衡對(duì)于有效清除細(xì)胞內(nèi)器官中的氧自由基非常重要[14]。

本研究檢測(cè)了腎臟勻漿中SOD、CAT和MDA的含量，用來評(píng)價(jià)大鼠腎臟抗氧化平衡。發(fā)現(xiàn)糖尿病組腎組織勻漿中MDA含量升高，SOD和CAT含量降低，提示DN狀態(tài)下腎組織勻漿中的氧化狀態(tài)失衡。而經(jīng)過西紅花苷治療后能降低MDA含量，升高SOD和CAT含量，同時(shí)血糖、BUN、ACR及Scr等血清學(xué)指標(biāo)均明顯下降，說明西紅花苷可調(diào)節(jié)血糖及提高抗氧化能力，發(fā)揮對(duì)DN大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用。Jnaneshwari等[15]報(bào)道通過對(duì)Wistar大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺造成內(nèi)源性ROS升高，引起氧化失衡狀態(tài)，西紅花苷(10 mg/kg)口服給藥 6 d 后上述病理學(xué)改變可明顯改善。Shirali 等[8]應(yīng)用西紅花苷對(duì)STZ誘導(dǎo)的 2 型糖尿病大鼠治療5個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)大鼠狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，毛色更加潔白光亮，且血糖水平及氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯降低。以上數(shù)據(jù)均表明西紅花苷對(duì)糖尿病均有較好的治療效果，與本研究結(jié)果相一致。另有研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，DN也與促炎細(xì)胞因子的增加有關(guān)。為了揭示西紅花苷抗DN過程中腎損傷的確切機(jī)制，我們研究了其對(duì)炎癥途徑的影響。DN過程中腎臟損傷的異常炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)了炎癥的分子途徑[18]。Ayepola等[19]研究表明，在腎損傷疾病中促炎介質(zhì)的顯著增加證明器官損傷和功能障礙的嚴(yán)重程度與促炎介質(zhì)的水平呈正相關(guān)。Malik等[20]發(fā)現(xiàn)，DN狀態(tài)下腎組織中NF-κB、TNF-α、IL-6水平明顯升高。然而，應(yīng)用西紅花苷后，炎癥因子均明顯降低。這說明西紅花苷可減輕與DN相關(guān)的腎損傷，參與抑制分子炎癥途徑。結(jié)果提示，對(duì)DN大鼠給予西紅花苷對(duì)預(yù)防腎功能損傷具有良好的保護(hù)作用，至少部分是通過改善炎癥信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，我們證明西紅花苷可有效緩解DN過程中的大鼠腎臟損傷。這種保護(hù)作用表現(xiàn)為改善腎臟損傷時(shí)血清相關(guān)指標(biāo)、氧化/抗氧化失衡和抑制分子炎癥途徑。當(dāng)然，DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，西紅花苷對(duì)DN大鼠腎臟損傷的防治效果有待進(jìn)一步深入探討。