miR-221對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

路 璐, 李 歡

0引言

miRNA為短鏈的非編碼內(nèi)源性保守的微小RNA分子，其通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程及調(diào)控信號通路的活性，在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1]。miR-221在機(jī)體多種腫瘤中均出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)，其在糖尿病引起的疾病中也有重要作用[2]，但是其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能及作用機(jī)制研究甚少。本研究擬以高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HRCECs為研究對象，檢測其中miR-221、p53、MDM2的表達(dá)，觀察過表達(dá)miR-221、抑制miR-221、過表達(dá)MDM2對高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的影響，揭示miR-221促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的機(jī)制與P53/MDM2信號通路有關(guān)。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HRCECs購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；Trizol液購自上海恪敏生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自北京宜科思源科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京艾然生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。P53抗體購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；MDM2抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HRCECs用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組將正常培養(yǎng)的HRCECs細(xì)胞分為NG組、HG組、HG+miR-NC組、HG+miR-221組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組。各組細(xì)胞的處理方法分別為：NG組：用5mmol/L的葡萄糖處理48h的HRCECs細(xì)胞；HG組：用30mmol/L的葡萄糖處理48h的HRCECs細(xì)胞；將miR-NC、miR-221 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-221、miR-221 mimics+pcDNA 3.1、miR-221 mimics+pcDNA 3.1-MDM2按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書的操作步驟轉(zhuǎn)染至HRCECs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5h后，棄去培養(yǎng)液更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，用qRT-PCR法確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到要求。轉(zhuǎn)染成功后用30mmol/L的葡萄糖處理培養(yǎng)48h，分別標(biāo)記為HG+miR-NC組、HG+miR-221組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 qRT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-221、p53、MDM2的表達(dá)Trizol法提取對數(shù)生長期的細(xì)胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，合成模板鏈cDNA。按照反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后通過分析Ct值，以U6、β-actin為內(nèi)參，計(jì)算定量結(jié)果，以2-△△Ct法測定miR-221、p53、MDM2的相對表達(dá)水平。引物信息(5’-3’)：miR-221上游引物ACACTCCAGCTGGGGAAACCCAGCAGACAA，下游引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGT；p53上游引物TGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGAC，下游引物CTGACGCACACCTATTGCAAGCAAGGGTTC；MDM2上游引物CACCTCACAGATTCCAGCTT，下游引物CGCCAAACAAATCTCCTAGA；β-actin上游引物GGACTTCGAGCAAGAGATGG，下游引物AGCACTGTGTTGGCGTACAG；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中p53、MDM2的蛋白表達(dá)將對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行冰上蛋白裂解1h，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5min，離心取上清，取60μg目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。然后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入一抗(1∶1000稀釋的P53抗體、MDM2抗體)中反應(yīng)過夜，以封閉液洗膜3次，每次5min，再在37℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入二抗(1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)中反應(yīng)2h。于暗室內(nèi)ECL試劑盒顯影曝光：滴加化學(xué)發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One 4.62圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡將1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5μL的Annexin V-/FITC避光反應(yīng)20min后再加入5μL的PI避光反應(yīng)20min，用300目銅篩過濾，最后在1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測。細(xì)胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1 miR-221在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果如圖1所示，與NG組相比，HG組細(xì)胞中miR-221表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.863，P<0.05)。

圖1 miR-221在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中的表達(dá) aP<0.05 vs NG組。

2.2 p53和MDM2在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果如圖2所示，與NG組相比，HG組細(xì)胞中p53的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(t=15.274、16.127，均P<0.05)，MDM2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(t=22.472、16.994，均P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 p53和MDM2在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中的表達(dá) A：p53、MDM2在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞的mRAN的表達(dá)；B：p53、MDM2在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞的蛋白表達(dá)。aP<0.05 vs NG組。

2.3過表達(dá)miR-221對高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如圖3所示，NG組、HG組、HG+miR-NC組、HG+miR-221組細(xì)胞凋亡率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.506，P<0.01)。與NG組相比，HG組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-221組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 過表達(dá)miR-221對高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的影響 aP<0.05 vs NG組，cP<0.05 vs HG+miR-NC組。

2.4抑制miR-221對高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中p53、MDM2表達(dá)及凋亡的影響結(jié)果如圖4所示，HG組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組細(xì)胞中p53 mRNA和蛋白表達(dá)、MDM2 mRNA和蛋白表達(dá)、凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=707.353、211.787、372.761、334.887、170.664，均P<0.01)。與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-221組細(xì)胞中p53的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，MDM2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5過表達(dá)MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如圖5所示，HG組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組細(xì)胞凋亡率、p53蛋白表達(dá)、MDM2蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.442、347.115、621.257，均P<0.01)。與HG組相比，HG+miR-221+pcDNA 3.1組細(xì)胞凋亡率顯著升高，p53蛋白表達(dá)顯著升高，MDM2蛋白表達(dá)顯著降低，HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組細(xì)胞凋亡率顯著降低，p53蛋白表達(dá)顯著降低，MDM2蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HG+miR-221+pcDNA 3.1組相比，HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組細(xì)胞凋亡率顯著降低，p53蛋白表達(dá)顯著降低，MDM2蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 過表達(dá)MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的影響 A：過表達(dá)MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡的影響；B：過表達(dá)MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中p53、MDM2蛋白表達(dá)的影響。aP<0.05 vs HG組,cP<0.05 vs HG+miR-221+pcDNA 3.1組。

3討論

miRNA參與人類機(jī)體的多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其中包括糖尿病[3-4]。由于miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，因此其在疾病中的作用機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，miR-221在糖尿病腎病、糖尿病心臟疾病中均出現(xiàn)異常表達(dá)[5-6]。Daniel等[7]報(bào)道，miR-221和miR-222在糖尿病小鼠血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)糖尿病小鼠的血管內(nèi)膜增厚，而抑制上調(diào)的miR-221和miR-222可有效預(yù)防糖尿病心血管疾病，其可能與細(xì)胞外信號應(yīng)答激酶-1/2(ERK-1/2)和p27Kip1有關(guān)。Liu等[8]在研究中報(bào)道，miR-221在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中的表達(dá)水平明顯的上調(diào)，并與患者的總體存活率具有顯著的相關(guān)性，更重要的是，miR-221的診斷效率明顯的高于Ang Ⅱ、VEGF，揭示血清miR-221作為潛在的生物標(biāo)志物不僅與T2DM患者DR的發(fā)生有關(guān)，而且與DR的進(jìn)展有關(guān)。遺憾的是，沒有繼續(xù)進(jìn)行miR-221在糖尿病視網(wǎng)膜病變的體外研究。本研究用高糖誘導(dǎo)了HRCECs建立糖尿病視網(wǎng)膜病變的體外研究細(xì)胞模型，檢測了其中miR-221的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-221高表達(dá)，這與Liu等[8]在患者血清中的檢測結(jié)果相呼應(yīng)；進(jìn)一步研究，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)miR-221在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞中的作用發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-221后，高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞的凋亡率上調(diào)更嚴(yán)重，并上調(diào)p53、下調(diào)MDM2， 抑制miR-221則起相反的作用抑制凋亡作用，這說明miR-221在高糖誘導(dǎo)的HRCECs凋亡中具有促進(jìn)作用，提示miR-221具有促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的惡性進(jìn)展的作用，推測可能與p53/MDM2通路相關(guān)，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

p53為一種可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡核磷酸蛋白，其在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)大量積累[9-10]。MDM2是一種負(fù)向調(diào)節(jié)p53的下游因子，其可通過與p53結(jié)合引起其泛素化降解，從而抑制p53引起的凋亡級聯(lián)反應(yīng)[11-13]。有研究報(bào)道，MDM2過度表達(dá)時(shí)，可抑制p53的功能[14]。郭承偉等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，在糖尿病視神經(jīng)病變大鼠模型中，p53的表達(dá)明顯升高，MDM2的表達(dá)明顯降低，大黃蟲丸治療后，p53、MDM2的表達(dá)得到平衡，可見，p53/MDM2通路在糖尿病視神經(jīng)病變中的關(guān)鍵作用。本研究檢測了高糖誘導(dǎo)了HRCECs細(xì)胞中p53、MDM2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，p53的表達(dá)升高，MDM2的表達(dá)降低，二者呈明顯的負(fù)相關(guān)，這與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均相一致；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p53、MDM2的表達(dá)水平受miR-221的調(diào)控，這為p53/MDM2信號通路的調(diào)控機(jī)制研究提供參考依據(jù)；深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MDM2可逆轉(zhuǎn)抑制miR-221的抗高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞凋亡，這說明不僅miR-221可調(diào)控p53/MDM2信號通路，相反，MDM2也可反向調(diào)控miR-221在高糖誘導(dǎo)的HRCECs細(xì)胞的功能。

綜上所述，miR-221可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控p53/MDM2信號通路調(diào)控有關(guān)，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供新靶點(diǎn)。