高糖對人角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)中Cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響

趙楠楠， 陳梨萍, 修 皓, 鄭振優(yōu), 唐 平, 籍雪穎

0引言

糖尿病性角膜病變(diabetic keratopathy, DK)臨床常見于持續(xù)性角膜上皮缺損、角膜潰瘍、內(nèi)眼術(shù)后角膜上皮再生延遲等[1]，嚴(yán)重影響視力，甚至致盲。角膜上皮病變和創(chuàng)傷延遲修復(fù)的機制，以及其與糖尿病的關(guān)系，是眼科當(dāng)前學(xué)術(shù)研究熱點。高血糖狀態(tài)下，機體代謝異常導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能受損。細(xì)胞周期素蛋白(Cyclin)與細(xì)胞分化、增殖密切相關(guān)。角膜上皮細(xì)胞受損后其修復(fù)過程需要細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂，需要由細(xì)胞分裂的間期進(jìn)入到分裂期，在細(xì)胞周期進(jìn)程中，Cyclin D1是G1期細(xì)胞周期素，其主要調(diào)控節(jié)點是G1/S期，Cyclin D1能夠激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，從而使細(xì)胞由G1期進(jìn)入到S期，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行[2]，故Cyclin D1在角膜上皮細(xì)胞修復(fù)過程中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力的作用，對角膜上皮修復(fù)快慢及成功與否起著至關(guān)重要的作用。Cyclin D1是Wnt信號通路β-catenin下游靶基因，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移。有研究證實核糖核酸酶5可上調(diào)Cyclin D1蛋白通過啟動細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)角膜內(nèi)皮損傷愈合[3]。在此基礎(chǔ)上我們推測DK與角膜上皮細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)存在一定的關(guān)系。研究證實，與正常組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)相比，當(dāng)葡萄糖濃度高于25mmol/L時，隨著葡萄糖濃度的增加，人角膜上皮細(xì)胞的增殖活性降低，并且呈時間和濃度依賴性[4]。張穎[5]的研究同樣顯示，葡萄糖濃度為25mmol/L時最適合制作人角膜上皮細(xì)胞高糖模型，故本實驗選取25mmol/L為高糖作用濃度，旨在探討高糖環(huán)境下，觀察不同時間點人角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能修復(fù)的差異，以及人角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)過程中細(xì)胞周期素Cyclin D1 蛋白基因表達(dá)的意義，以期為進(jìn)一步防控糖尿病性角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲提供新的實驗理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料人角膜上皮細(xì)胞：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；貨號：BNCC337876，高糖DMEM：Hyclone；貨號：SH30022.01，F(xiàn)BS：Gibco；貨號：10099141，雙抗：Hyclone；貨號：SV30010，胰蛋白酶0.25%, Trypsin-EDTA (1×)溶液：Gibco；貨號：25200056, DMSO：Sigma；貨號：D2650，抗Cyclin D1抗體(兔抗)：Abcam；貨號：ab134175，二抗山羊抗兔：Abcam；貨號：ab6721，抗β-actin抗體(鼠抗)：Abcam；貨號：ab4990，二抗山羊抗鼠：Abcam；貨號：ab6785，ECL顯色液：Millipore；貨號：WBKLS0100，熒光染料SYBR Green Mix (2×)：Thermo：K0221，蛋白maker：Fermentas：貨號：26617。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞處理和總RNA及總蛋白提取細(xì)胞復(fù)蘇后，用完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%FBS)重懸，放置在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%以上后，進(jìn)行傳代：將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以1×104/孔接種于培養(yǎng)板，37℃，0.5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代1～2代后，按上述傳代方法將細(xì)胞傳至直徑為35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，共傳10皿，并分為兩組：高糖處理組和正常對照組，于37℃，0.5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，將高糖處理組培養(yǎng)基更換為含25mmol/L葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基，正常對照組則更換為加等體積蒸餾水的DMEM完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞長滿后，進(jìn)行劃傷處理，每皿呈“#”字形劃傷處理[6]。分別培養(yǎng)0、12、24、48、72h后提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，并測定總RNA(Nanodrop 2000測定)及總蛋白濃度(BCA法測定)。

1.2.2 qRT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA的表達(dá)根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用Transcriptor First-Strand cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientifci, Waltham, MA, USA)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR：Cyclin D-F：CTCGGTGTCCTACTTCAAATGT； Cyclin D-R：TCCTCGCACTTCTGTTCCT；β-actin-F：ACCCTGAAGTACCCCATCGAG；β-actin-R：ACATGATCTGGGTCATCTTCTC。qRT-PCR擴增體系為：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×) 12.5μL，正反向引物各1μL，cDNA 500 ng，ddH2O補充至25μL。反應(yīng)程序為：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，40 cycles；熔解曲線。

1.2.3 Western blot檢測Cyclin D1蛋白的表達(dá)將提取的各時間點總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，進(jìn)行常規(guī)Western blot實驗，檢測劃傷條件下高糖處理組和正常對照組不同時間(0、12、24、48和72h)角膜上皮細(xì)胞中Cyclin D1蛋白的表達(dá)。配制SDS-PAGE凝膠(4%濃縮膠，12%分離膠)，根據(jù)不同時間點總蛋白濃度計算各時間點用量(蛋白用量為2μg)，加入對應(yīng)量的5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮沸5～8min，冰浴5min后上樣，80V電泳至蛋白到達(dá)分離膠時將電壓改為100V繼續(xù)電泳1～2h(根據(jù)具體需要進(jìn)行調(diào)整)，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，加入兔抗人Cyclin D1一抗，4℃孵育過夜，PBST沖洗3次后加入山羊抗兔二抗，室溫輕微震蕩孵育2h，PBST沖洗3次，黑暗條件下加入ECL反應(yīng)5～15min，在BioRad化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光1～15min，以β-actin為內(nèi)參。

在倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長狀況及其變化，選取各組細(xì)胞不同時間點劃痕處清晰且寬度基本一致、細(xì)胞形態(tài)明顯處進(jìn)行觀察拍照。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0分析數(shù)據(jù)，多組之間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，各組的時間差異比較，采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，各時間點的組間差異比較，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1角膜上皮細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察利用倒置顯微鏡，對劃傷刺激條件下正常對照組和高糖處理組細(xì)胞進(jìn)行觀察(圖1)。結(jié)果顯示：劃傷處理前即處理0h的細(xì)胞，細(xì)胞沒有顯著差別，細(xì)胞呈比較均勻的扁平單層貼壁生長，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞膜光滑，細(xì)胞核透亮，整體上高糖處理組的細(xì)胞生長較正常對照組緩慢。劃傷處理12h和24h后，劃傷處細(xì)胞形態(tài)并無多大差別，但與正常對照組相比，高糖組劃傷邊緣處的漂浮細(xì)胞明顯要多，細(xì)胞重新貼壁情況差，間距增加。隨著處理的時間延長，劃傷處由前面的不平整逐漸趨于平滑，且細(xì)胞開始重新向劃傷處外緣生長。劃傷處理48h顯示，高糖處理組的細(xì)胞生長速度要比正常對照組慢，劃傷處不如對照組平整，向外伸出的細(xì)胞突起較對照組少。劃傷處理72h，兩組劃傷處邊緣的細(xì)胞突起明顯增多，細(xì)胞密度明顯增大，但是正常對照組細(xì)胞狀態(tài)明顯要好于高糖處理組，高糖處理組細(xì)胞形態(tài)有一定改變，明顯變圓，高糖處理組雖然細(xì)胞突起增大，但是劃傷邊緣的凹陷仍然較多，對照組則沒有這種情況，這反映高糖組的細(xì)胞活性較差。

2.2 qRT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平比較對qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=350.985，P時間<0.001；F交互=2.893，P交互<0.001；F組間=1906.661，P組間<0.001)；兩組間12、24、72h比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。兩組各組內(nèi)不同時間點(12,24,48,72h)與各組的0h間Cyclin D1表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(正常對照組：t12h vs 0h=-0.843，P12h vs 0h<0.001；t24h vs 0h=-0.927，P24h vs 0h<0.001；t48h vs 0h=-0.793，P48h vs 0h<0.001；t72h vs 0h=-0.840，P72h vs 0h=<0.001。高糖處理組：t12h vs 0h=-0.687，P12h vs 0h<0.001；t24h vs 0h=-0.483，P24h vs 0h<0.001；t48h vs 0h=-0.773，P48h vs 0h<0.001；t72h vs 0h=-0.710，P72h vs 0h<0.001)，見表1。

表1 各組細(xì)胞中不同時間點Cyclin D1 mRNA表達(dá)情況

qRT-PCR匯總結(jié)果如圖2示：高糖處理組和正常對照組中Cyclin D1的表達(dá)均隨著處理時間延長而下調(diào)，各時間點的表達(dá)量與0h比，均存在顯著差異，其中對照組中最低表達(dá)量出現(xiàn)在24h，其表達(dá)量僅為0h的0.08倍，處理組中最低表達(dá)量出現(xiàn)在48h，其表達(dá)量為0h的0.25倍。高糖處理后，與正常對照組相比，Cyclin D1 mRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢，但隨著高糖處理時間延長，上調(diào)作用減弱，且在48h處mRNA水平恢復(fù)至與對照組同一水平。

圖2 劃傷條件下，高糖處理組不同時間點Cyclin D1 mRNA的表達(dá) n=3，aP<0.05 vs 正常對照組。

2.3 Western blot檢測Cyclin D1表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示見圖3。劃傷刺激能夠上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，隨著時間的延長上調(diào)作用逐漸減弱，無論是正常對照組還是高糖處理組，其最高表達(dá)量出現(xiàn)在12h。高糖處理組與正常對照組相比，高糖處理組各時間點的Cyclin D1表達(dá)量均低于正常對照組，提示，高糖處理對Cyclin D1的表達(dá)存在抑制作用。因此，Western blot 實驗結(jié)果顯示，劃傷刺激能夠上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，且25mmol/L葡萄糖處理能夠減弱劃傷刺激對Cyclin D1的上調(diào)作用，高糖能夠抑制Cyclin D1的表達(dá)。

圖3 Western blot檢測處理不同時間位點Cyclin D1蛋白表達(dá)。

3討論

目前中國成為全球糖尿病患者最多的國家之一，在眼科領(lǐng)域，糖尿病患者角膜創(chuàng)傷延遲愈合的發(fā)生率較高[7]，為臨床帶來諸多棘手的病癥，譬如角膜上皮糜爛、大皰性角膜病變、反復(fù)的角膜潰瘍甚至致盲，成為眼科學(xué)亟待解決的問題。DK的發(fā)病機制尚不明確，研究高血糖對DK發(fā)展的病理影響，目前主要集中在細(xì)胞和分子水平研究。Zhang 等[8]報道外源性netrin-1促進(jìn)糖尿病小鼠角膜上皮傷口愈合和神經(jīng)纖維再生，而高糖可阻斷創(chuàng)傷誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞netrin-1表達(dá)上調(diào)。2型糖尿病合并角膜點狀上皮病變患者的基底下神經(jīng)叢及基底上皮細(xì)胞減少導(dǎo)致角膜上皮愈合延遲[9]。另外，高糖狀態(tài)可以降低細(xì)胞間黏附能力，從而造成角膜上皮細(xì)胞的損傷[10]。Song 等[11]研究也證實胰島素依賴型糖尿病可以改變角膜的正常節(jié)律性，減少角膜上皮有絲分裂,增加角膜炎性因子的表達(dá)。以上研究均表明高糖呈負(fù)性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞損傷，神經(jīng)組織受損，修復(fù)再生延遲。

參考針對糖尿病角膜上皮細(xì)胞病變機制與高糖狀態(tài)下人角膜上皮細(xì)胞增殖、凋亡模型的文獻(xiàn)研究[4-5]，篩選出最適高糖濃度及處理時間，以高糖下體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞為研究對象，模擬DK的高糖微環(huán)境,通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞劃傷刺激后的生長情況和形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞劃傷后，細(xì)胞遷移能力受損。與正常對照組相比，高糖處理組遷移入創(chuàng)傷區(qū)的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞折光性弱，伸展不良，創(chuàng)傷區(qū)愈合率顯著降低，并且隨著處理的時間延長，高糖處理組的人角膜上皮細(xì)胞生長速度要比正常對照組慢，細(xì)胞突起少且活性較差，細(xì)胞分裂現(xiàn)象較正常對照組弱，提示高糖的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。

創(chuàng)傷作為一種刺激，可激活機體下游信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移至創(chuàng)傷區(qū)，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)-細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin dependent kinase, CDK)-細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子 (Cyclin dependent kinase inhibitor, CKI)系統(tǒng)是細(xì)胞增殖的內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng), 其中,Cyclin D1在細(xì)胞周期 G1 期啟動,是Wnt信號通路β-catenin下游靶基因，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移。Wnt信號通路在眼科學(xué)角膜病相關(guān)研究中尚處于起步階段，有研究證實人角膜上皮細(xì)胞有Cyclin D1 蛋白的表達(dá)，且Wnt1蛋白可促進(jìn)Cyclin D1蛋白基因的表達(dá)，且其表達(dá)量與Wnt1蛋白量呈正相關(guān)[12]。內(nèi)外環(huán)境刺激下，核糖核酸酶5上調(diào)Cyclin D1蛋白， D3等通過激活PI3激酶/AktCECs 啟動細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)角膜內(nèi)皮損傷愈合[3]?；诖?，我們初步推斷Cyclin D1蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期的作用下，促進(jìn)了角膜相關(guān)細(xì)胞活化增殖能力，呈正性調(diào)節(jié)作用，且與某些信號分子有關(guān)。在前期研究[12]基礎(chǔ)上，本實驗設(shè)置25mmol/L葡萄糖處理組和蒸餾水正常對照組，通過給予角膜上皮細(xì)胞劃傷刺激后，qRT-PCR檢測兩組組間差異性和時間點測量值的時間差異性分析，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。劃傷刺激后檢測兩組Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，高糖處理組與正常對照組相比，Cyclin D1 mRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢，但隨著高糖處理時間延長，上調(diào)作用減弱，且在48h處mRNA水平恢復(fù)至與對照組同一水平。而Western blot 檢測蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：高糖組在各時間點檢測的Cyclin D1蛋白表達(dá)量均低于正常組，提示高糖對Cyclin D1的表達(dá)存在抑制作用?；虻谋磉_(dá)調(diào)控存在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾及翻譯等水平的調(diào)控，RNA表達(dá)量就是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而蛋白表達(dá)量則收到轉(zhuǎn)錄后修飾及翻譯水平的調(diào)控，本研究中的Cyclin D1的RNA表達(dá)和蛋白表達(dá)量不一致，說明Cyclin D1在角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控可能存在轉(zhuǎn)錄后修飾或者翻譯水平的調(diào)控。另一方面，本實驗采用模擬高糖環(huán)境，與真正的糖尿病患者角膜上皮細(xì)胞所處環(huán)境有所差異，故不排除這是導(dǎo)致qRT-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果不一致的原因。劃傷刺激增加Cyclin D1的上調(diào)，而高糖環(huán)境下，人角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲，并隨時間延長呈進(jìn)行性損害，Cyclin D1表達(dá)受損，從而導(dǎo)致細(xì)胞在相應(yīng)的時相受阻，細(xì)胞周期循環(huán)不能進(jìn)行，細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂，從而誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。另外，也有研究顯示，高糖通過活性氧系統(tǒng)抑制表皮生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制角膜上皮細(xì)胞損傷后修復(fù)[13]，多種信號通路系統(tǒng)參與調(diào)控角膜創(chuàng)傷愈合，這與本實驗結(jié)論相一致，但是Cyclin D1是否可以作為藥物相關(guān)靶基因，尚需更多研究加以證實。

角膜上皮微環(huán)境的動態(tài)平衡對維持正常視力和上皮組織的完整性極為重要，人角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)有助于了解角膜細(xì)胞的生物學(xué)特性、構(gòu)建體外疾病模型、構(gòu)建生物人工角膜[14]以及更好地發(fā)揮其臨床作用[15]，譬如利用Rock抑制劑聯(lián)合低氧-常氧培養(yǎng)方式構(gòu)建工程角膜上皮[16]，有助于深入認(rèn)識角膜上皮病變的病理生理過程，為角膜病的發(fā)病機制提供新的思路。本實驗采用25mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)基，角膜上皮細(xì)胞生長環(huán)境為高滲狀態(tài)，高滲透壓可能影響細(xì)胞功能及炎性介質(zhì)功能。譬如譚秋凡等[17]研究在高滲條件下，炎癥小體各聚合成分和炎癥因子的mRNA水平上調(diào)，人角膜上皮細(xì)胞中c-Jun氨基末端蛋白激酶對其釋放的具有抑制作用。本實驗未把滲透壓因素作為研究變量，可能對結(jié)果有一定影響。但高糖對角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)的影響，是否與高滲作用有關(guān)，也需要通過后續(xù)實驗驗證。細(xì)胞周期蛋白在眼表疾病的科研應(yīng)用國內(nèi)外鮮有研究報道，且機制較為復(fù)雜，我們實驗初步探索下存在不足之處，也缺少針對蛋白的統(tǒng)計與量化，尚待開展更多高質(zhì)量研究進(jìn)一步優(yōu)化，彌補不足。

綜上所述，由于糖尿病導(dǎo)致的疾病流行率、相關(guān)醫(yī)療費用[18]和視力損害的增加，因此，臨床醫(yī)生理應(yīng)重視并加強對DK的探索。本次實驗初步探討了高糖狀態(tài)下角膜上皮細(xì)胞增殖與分化的潛在機制，以及細(xì)胞周期素Cyclin D1 蛋白基因表達(dá)的相關(guān)意義，有助于深入了解糖尿病性角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲的分子調(diào)控機制，并為DK研究提供新的實驗理論依據(jù)。

2師忠芳, 韓明, 徐立新等.體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷模型.中國康復(fù)理論與實踐 2007；13(12):1132-1133