d-δ-生育酚抑制人晶狀體上皮SRA細(xì)胞生長(zhǎng)及相關(guān)機(jī)制

秦 程，曾新生，彭 勃，唐玉妮，周友弟，宋 博

0引言

白內(nèi)障超聲乳化吸除術(shù)聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)已成為治療白內(nèi)障的主要手段。然而，術(shù)后后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)仍是影響治療效果的重要因素。術(shù)后PCO即后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障手術(shù)后常見的并發(fā)癥，是影響治療效果的主要因素。PCO的形成主要是術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞過度增殖并移行于后囊膜，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生膠原、分泌基底膜樣物質(zhì)而引起[1]。

天然維生素E(natural vitamin E)，學(xué)名生育酚(tocopherols)，生育酚同系物在自然界中廣泛分布并且主要存在于各種植物中。d-δ-生育酚是其中的一種[2]。研究表明d-δ-生育酚在減少炎癥、細(xì)胞增殖和腫瘤負(fù)擔(dān)方面表現(xiàn)出了更大的能力[3]。我們通過實(shí)驗(yàn)探究d-δ-生育酚對(duì)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及所涉及的相關(guān)分子機(jī)制，可能與凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax或者與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CyclinD1、P21相關(guān)，以便發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮作用的具體靶點(diǎn)，為d-δ-生育酚發(fā)揮其藥物學(xué)功能，也為治療及預(yù)防PCO提供理論支持。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株:人晶狀體上皮SRA細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所)、d-δ-生育酚(北京索萊寶科技有限公司)、RIPA裂解液、MTT試劑、二甲基亞砜，碘化丙啶，新生牛血清、1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。主要儀器：分選型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、超高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Zeiss公司)、光柵型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、研究級(jí)倒置熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡(日本Olympus)、MLDEL酶標(biāo)儀(美國(guó)Coulter公司)，P21、Cyclin D1、bax及bcl-2抗體均產(chǎn)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，MTT檢測(cè)結(jié)果及IC50(半抑制率)值，篩選出5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度。將此次實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(0μmol/L)及實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)不同濃度的d-δ-生育酚(40、60、80、100、120μmol/L)，分別處理人晶狀體上皮SRA細(xì)胞24、48、72h，使用20%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞，在5.0% CO2飽和度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察d-δ-生育酚處理人晶狀體上皮SRA細(xì)胞24、48、72h后，顯微鏡下觀察人晶狀體上皮SRA細(xì)胞的增殖及細(xì)胞形態(tài)的變化，拍照記錄結(jié)果。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SRA細(xì)胞，胰酶消化、離心、計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為3.5×106/L，接種到96孔板，每個(gè)孔加入200μL，放于37.0℃、5.0% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，按所設(shè)藥物濃度分別加入d-δ-生育酚，培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入20μL的MTT培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，吸凈舊液，每孔加入200μL DMSO(二甲基亞砜)，使用波長(zhǎng)為490nm，酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD值，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算d-δ-生育酚對(duì)組胞增殖率的影響，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。往培養(yǎng)瓶中加入d-δ-生育酚，使其濃度分別為設(shè)定濃度，藥物作用48h后用PBS洗兩遍，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1000r/min, 5min，離心，加入5mL 75.0%預(yù)冷乙醇中，輕輕吹打均勻，-20℃固定保存。1000r/min, 5min，離心，PBS輕輕吹打細(xì)胞，洗兩遍。0.5mL PBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度50μg/mL，37.0℃溫浴30min。上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)d-δ-生育酚刺激人晶狀體上皮SRA細(xì)胞P21、Cyclin D1、bax、bcl-2蛋白表達(dá)情況將人晶狀體上皮SRA細(xì)胞傳代后分6組。使其濃度分別為設(shè)定濃度，提取細(xì)胞蛋白，BCA法蛋白濃度定量，配制好15%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔加入30μg為蛋白上樣量，上樣前沸水中煮沸5min使蛋白變性。準(zhǔn)備電泳，先80V恒壓，30min，等待濃縮膠跟分離膠分離之后，再調(diào)整電壓至120V，50min。電泳結(jié)束后，恒定電流260mA，50min轉(zhuǎn)膜，把轉(zhuǎn)好的膜放入5%的脫脂奶粉封閉液中，搖床上室溫封閉2h，封閉結(jié)束后，TBST洗3次，一次10min，放入提前配好的一抗孵育盒中(P21為1∶500；Cyclin D1為1∶500；bax為1∶1000；bcl-2為1∶1000)，4℃慢搖過夜，次日用TBST洗3次，一次10min，放入二抗孵育盒中，室溫下慢搖1h，TBST洗3次，一次10min，發(fā)光。發(fā)光結(jié)束后得到目的條帶，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1倒置相差顯微鏡下觀察d-δ-生育酚對(duì)SRA細(xì)胞形態(tài)的影響體外培養(yǎng)人晶狀體SRA細(xì)胞呈多邊形，胞體邊界清楚，貼壁生長(zhǎng)，胞質(zhì)均勻，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快。d-δ-生育酚處理細(xì)胞48h后，倒置相差顯微鏡下觀察，隨著d-δ-生育酚的濃度逐漸增加，SRA細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞密度逐漸變低，漂浮的死亡細(xì)胞逐漸增多，部分細(xì)胞皺縮變圓、貼壁不牢，見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察48h后d-δ-生育酚對(duì)SRA細(xì)胞增殖的影響(100×) A：對(duì)照組；B：40μmol/L組；C：60μmol/L組；D：80μmol/L組；E：100μmol/L組；F：120μmol/L組。

2.2不同濃度d-δ-生育酚對(duì)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞增殖的影響MTT法結(jié)果顯示，d-δ-生育酚分別作用于人晶狀體上皮SRA細(xì)胞24、48、72h后，SRA細(xì)胞的增殖受到抑制，隨著d-δ-生育酚濃度的逐漸增加，人晶狀體上皮SRA細(xì)胞的增殖率也逐漸降低，隨著d-δ-生育酚濃度的增高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SRA細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，這種關(guān)系范圍在(40～120μmol/L)之間最為明顯。分析結(jié)果顯示，24、48、72h，六組抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，進(jìn)一步做兩兩比較,三個(gè)時(shí)點(diǎn)結(jié)果都表現(xiàn)為對(duì)照組<40μmol/L組<60μmol/L組<80μmol/L組<100μmol/L組<120μmol/L組，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度組不同時(shí)間抑制率比較

2.3 d-δ-生育酚對(duì)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞周期的影響根據(jù)MTT的結(jié)果分析，人晶狀體上皮SRA細(xì)使用d-δ-生育酚處理48h后，藥物達(dá)到最有效抑制細(xì)胞增殖效果，故選取d-δ-生育酚處理細(xì)胞48h后作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。如圖2示細(xì)胞被阻滯于S期，六組S期細(xì)胞率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.447，P<0.001)，兩兩比較結(jié)果見表2。

圖2 d-δ-生育酚對(duì)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞周期的影響 A：對(duì)照組；B：40μmol/L組；C：60μmol/L組；D：80μmol/L組；E：100μmol/L組；F：120μmol/L組。

表2 不同濃度組S期細(xì)胞率比較

2.4 Western blot檢測(cè)Cyclin D1、P21、bax和bcl-2的表達(dá)d-δ-生育酚干預(yù)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞48h后，人晶狀體上皮SRA細(xì)胞P21、Cyclin D1和bcl-2表達(dá)量逐漸降低，bax表達(dá)量逐漸增高，見圖3。不同濃度組各蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，各蛋白兩兩組間比較結(jié)果,見表3。

圖3 Western blot檢測(cè)Cyclin D1、P21、bax和bcl-2的表達(dá)。

表3 不同濃度組各蛋白表達(dá)水平比較

3討論

正常的人晶狀體上皮細(xì)胞為單層立方上皮,主要位于前囊下和赤道部，具有增殖和分化的能力,并且不斷的產(chǎn)生晶狀體纖維[4]。白內(nèi)障摘除術(shù)術(shù)后,人晶狀體上皮細(xì)胞失去單層性及晶狀體皮質(zhì)的壓力，加速轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞[5]，形成后發(fā)性白內(nèi)障。據(jù)報(bào)道，多達(dá)20%～30%的患者術(shù)后會(huì)發(fā)生后發(fā)性白內(nèi)障[6]，成人在2～5a內(nèi)后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率高達(dá)50%，兒童術(shù)后早期即可發(fā)生嚴(yán)重的PCO，兒童晶狀體上皮細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，因而PCO的發(fā)生概率高達(dá)100%[7]。目前治療后發(fā)性白內(nèi)障主要是激光后囊膜切開術(shù)，激光后囊膜切開術(shù)會(huì)伴有人工晶狀體(intraocular lens，IOL)偏離、眼壓升高、葡萄膜炎、黃斑水腫、甚至視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥[8-9]。除了手術(shù)治療后發(fā)性白內(nèi)障之外，目前臨床上對(duì)后發(fā)性白內(nèi)障的藥物治療及防治也有了大量的研究。許多藥物已被證實(shí)可有效抑制人晶狀體上皮細(xì)胞增生，如地塞米松、雙氯芬酸鈉、皂草素、姜黃素等。有研究表明，通過IOL而釋放藥物是藥物作用的最佳途徑，其原理是將抑制細(xì)胞增殖的藥物以不同方式修飾于IOL表面或浸潤(rùn)、裝載于IOL中，這種方式可以使白內(nèi)障術(shù)后的藥物逐漸釋放從而抑制PCO的形成[10]。但是這些藥物在起效的同時(shí)對(duì)眼內(nèi)其他結(jié)構(gòu)，包括對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等產(chǎn)生損害，可引起虹膜色素沉著、暫時(shí)性角膜水腫和黃斑水腫等并發(fā)癥。這也是這些藥物使用的限制性因素。而d-δ-生育酚在綠色植物中容易獲得且安全，是一種天然藥物，與其他藥物相比有更好的優(yōu)越性，并發(fā)癥少。研究發(fā)現(xiàn)d-δ-生育酚在減少炎癥、細(xì)胞增殖和腫瘤負(fù)擔(dān)方面表現(xiàn)出了更大的能力[3]。而人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖與癌細(xì)胞的不斷增殖有共性。因此推測(cè)d-δ-生育酚可能通過某些作用機(jī)制而抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，在顯微鏡下觀察，對(duì)照組人晶狀體上皮SRA細(xì)胞呈多邊形，胞體邊界清楚，胞質(zhì)均勻，生長(zhǎng)速度快。而實(shí)驗(yàn)組SRA細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞密度變低，漂浮的死亡細(xì)胞明顯增多。隨著d-δ-生育酚的濃度逐漸增加，細(xì)胞的增殖明顯受抑制，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。120μmol/L的d-δ-生育酚作用48h后，抑制率達(dá)(70.19±2.26)%。

細(xì)胞周期結(jié)果顯示：d-δ-生育酚能明顯抑制人晶狀體上皮SRA細(xì)胞的增殖，并阻滯細(xì)胞周期于S期。Western blot檢測(cè)結(jié)果分析，d-δ-生育酚抑制人晶狀體上皮SRA細(xì)胞的增殖可能是通過抑制bcl-2、P21、Cyclin D1的表達(dá)，誘導(dǎo)bax的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果對(duì)d-δ-生育酚用于后發(fā)性白內(nèi)障的靶向治療提供一種新的思路。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，經(jīng)d-δ-生育酚干預(yù)的人晶狀體上皮SRA細(xì)胞隨著藥物濃度的增加，P21表達(dá)量逐漸降低，與預(yù)期的結(jié)果相反，分析其原因可能有:(1)有研究表明，P21在不同組織如在腎臟、鼻咽癌細(xì)胞株等組織或者惡性腫瘤中表現(xiàn)為表達(dá)下降，對(duì)其細(xì)胞的增殖呈負(fù)向調(diào)控作用[11-12]，而在心臟、食管鱗狀細(xì)胞癌等組織中P21表現(xiàn)為高表達(dá)，對(duì)其細(xì)胞增殖的正向調(diào)控作用[13-14]。本研究在人晶狀體上皮SRA細(xì)胞研究中獲得低表達(dá)的結(jié)果提示P21在不同組織中的表達(dá)可能具有組織特異性，或者不同的藥物的作用機(jī)制可能對(duì)P21產(chǎn)生不同的調(diào)控作用。這一結(jié)果提示在人晶狀體上皮SRA細(xì)胞中，調(diào)控SRA細(xì)胞增殖的可能是CKI家族的其它成員，如Cyclin D1等。(2)P21蛋白為最早發(fā)現(xiàn)并克隆的CKI,可與多種CDK競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Cyclin D1,從而抑制細(xì)胞的增殖,并且可與PCNA結(jié)合，阻斷PCNA依賴的DNA復(fù)制，抑制CDK活性，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)受阻于G1期[15]。而細(xì)胞周期的結(jié)果顯示d-δ-生育酚使細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在了S期，說明d-δ-生育酚誘導(dǎo)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞周期阻滯的途徑與P21無關(guān)。(3)P21除了具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能外，也具有抗凋亡的雙重功能，本組人晶狀體上皮SRA細(xì)胞中P21低表達(dá)，是否發(fā)揮了抗細(xì)胞凋亡的作用，其確切關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)從幾個(gè)方面初步探討了d-δ-生育酚對(duì)人晶狀體上皮SRA細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響，能夠抑制人晶狀體上皮SRA細(xì)胞的增殖。但是本實(shí)驗(yàn)還有許多不足之處，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子很多，這些因子是否發(fā)揮了凋亡的作用等，對(duì)于確切的機(jī)制我們還需要進(jìn)一步的研究。d-δ-生育酚大量存在于綠色植物中，安全易獲取，值得深入研究。因此，我們將進(jìn)一步研究d-δ-生育酚在動(dòng)物模型體內(nèi)的應(yīng)用前景，以更好地為臨床PCO的防治提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。