反相高效液相色譜法測定益氣生血膠囊中黃芪甲苷含量的方法學(xué)研究

孫賓娟

益氣生血膠囊是結(jié)合多年臨床經(jīng)驗及諸代醫(yī)師經(jīng)驗相傳，應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)所制備的中藥制劑，其組方為黃芪、當(dāng)歸、連翹，其功效為益氣生血，針對面色、爪甲蒼白，神疲乏力，頭暈?zāi)垦?，心悸不寐，肌熱面熱，月?jīng)過多等癥有較好的治療作用[1-2]。由于益氣生血膠囊為自制的膠囊劑，尚未對其建立質(zhì)量標準；綜合考慮其組方中當(dāng)歸，連翹成分的鑒別、含量測定方法較多且成熟[3]，故本次研究針對黃芪中的黃芪甲苷建立含量測定方法。而結(jié)合多項研究[4-5]結(jié)果可知，黃芪甲苷峰與雜質(zhì)峰極性較為相似，較容易與雜質(zhì)峰出現(xiàn)包峰情況，故本次研究采用反相高效液相色譜法對黃芪甲苷進行測定，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國Agilent科技有效公司提供，型號1100)、真空脫氣機(型號G1379A)、四元泵(型號G1311A)、自動進樣器(型號G1313A)、紫外檢測器(型號G1314A)、HPChemB01.03工作站、數(shù)控超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司提供，型號KQ-600DV)、高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠提供，型號GL-12B)、純水儀(北京力源電子儀器有限公司提供，型號ED2N)、十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius科學(xué)儀器公司提供，型號CP225D)及pH計(德國Sartorius科學(xué)儀器公司提供，型號PB-10)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，高效液相色譜淋洗劑)、乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)、磷酸(西隴科學(xué)股份有限公司，分析純)D101大孔樹脂(15 mm×20 mm，廊坊圣泉化工有限公司)及純化水(實驗室自制)。

1.3 試藥 益氣生血膠囊 (院內(nèi)自制，批號190101、190202、190303)及黃芪甲苷標準品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號110781-200613)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，規(guī)格為150 mm×3.9 mm，5 μm；流動相：乙腈- 0.1磷酸溶液(30∶70)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：207 nm；進樣量：25 μL。樣品及標準品的色譜圖(見圖1～2)，色譜圖表明在該條件下，黃芪甲苷顯現(xiàn)良好。

圖1 黃芪甲苷對照品色譜圖(1為黃芪甲苷)

圖2 益氣生血膠囊樣品色譜圖(1為黃芪甲苷)

2.2 供試品溶液制備 精密稱量膠囊內(nèi)容物5 g，置于索氏提取器中，加入甲醇50 mL，冷浸12 h，再加入適量甲醇，于95℃下水浴加熱回流6 h，收集所提取的甲醇，置95℃下水浴蒸干，以水10 mL在60～80℃條件下溶解殘渣，以水飽和的正丁醇萃取2次，20 mL/次，收集并合并正丁醇液，以氨試液對正丁醇提取液洗滌2次，40 mL/次，收集并合并正丁醇液，置95℃下水浴蒸干，殘渣以甲醇充分溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加甲醇至容量瓶刻度，定容，搖勻，置超聲清洗器下超聲，即為供試品溶液。

2.3 對照品溶液制備 將黃芪甲苷對照品于60 ℃下減壓干燥24 h，立即精密稱量10 mg，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加甲醇至容量瓶刻度，定容，搖勻，即為2 mg/mL的對照品溶液。

2.4 標準曲線 以甲醇對2 mg/mL黃芪甲苷標準溶液進行逐級稀釋，制備不同含量的黃芪甲苷溶液，含量分別為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL及2 mg/mL；參照2.1項下的色譜條件進行測定，以進樣濃度為X坐標，以峰面積為Y坐標建立線性回歸，繪制標準曲線，其回歸方程為Y＝32 112＋68 750X(r＝0.999 8)，線性范圍為0.01～2 mg/mL。

2.5 精密度實驗 參照2.4項下的配制方法，制備不同含量的黃芪甲苷溶液，含量分別為0.03 mg/mL、0.06 mg/mL、1 mg/mL；參考2.1項下的色譜條件進行測定，將3個不同濃度的黃芪甲苷溶液各進5樣本，連續(xù)測定3 d，結(jié)合黃芪甲苷的峰面積數(shù)據(jù)，分別計算其日內(nèi)精密度及日間精密度，結(jié)果表明0.03 mg/mL黃芪甲苷溶液日內(nèi)與日間精密度分別為1.34%及1.67%，0.06 mg/mL黃芪甲苷溶液日內(nèi)與日間精密度分別為1.47%及1.59%，1 mg/mL黃芪甲苷溶液日內(nèi)與日間精密度分別為1.89%及1.97%；即以該方法進行測定，其日內(nèi)及日間精密度結(jié)果尚可。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別將其放置0、6、12、24、48 h后，進樣25 μL，記錄其峰面積數(shù)據(jù)[6-7]。結(jié)果表明供試品在放置不同時間后，其RSD值為2.14%；即供試品在48 h內(nèi)可持續(xù)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 參照2.2項下的供試品溶液制備方法，將3批膠囊樣品分別各制備5份供試品溶液，參照2.1項下的色譜條件，分別測定各供試品的黃芪甲苷含量，計算其含量平均值為1.25 mg/mL，RSD值為2.54%；即以該方法進行測定，其重復(fù)性尚可。

2.8 回收率實驗 參照2.2項下的供試品溶液制備方法，將已知含量的3份益氣生血膠囊 (批號190101，黃芪甲苷含量1.25 mg/mL)所制供試品溶液，分別加入3份黃芪甲苷對照品溶液中(含量分別為2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL)，在相同色譜條件下對黃芪甲苷含量進行測定，每份混合溶液各測定3次，并計算其平均回收率值為96.5%，平均RSD值為2.38%。

2.9 樣品測定 將3個不同批號的益氣生血膠囊樣品參照2.2項下的供試品溶液制備及2.3項下的對照品溶液制備進行黃芪甲苷的含量分析，參照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄并分析其圖譜，采用外標法對黃芪甲苷的含量進行計算，結(jié)果分別為1.24 mg/mL、1.26 mg/mL及1.28 mg/mL。

3 討論

3.1 樣品處理方法研究 黃芪甲苷本質(zhì)為黃芪多糖，是黃芪中的主要有效成分之一[8-10]，其生物活性為3種黃芪苷中最好的，以甲醇作為溶劑、以加熱回流的方式對樣品進行提取，且在提取前將樣品冷浸于溶劑中12 h，能夠使黃芪甲苷在其中更為充分溶解，使得提取率大大增加[11-12]；而后采用水飽和的正丁醇對樣品進行萃取，并以氨試液進行洗滌，可有效提升黃芪甲苷的提取率，除去供試品溶液中的部分雜質(zhì)[13]，最終所得圖譜表明，在黃芪甲苷出峰處雜質(zhì)峰較少，故以此處理樣品所得的供試品溶液能夠有效測定益氣生血膠囊中的黃芪甲苷含量。

3.2 流動相選擇 本次研究所采用的方法為反相高效液相色譜法，即由非極性固定相與極性流動相所組成的色譜體系[14]，可避免對照品峰與雜質(zhì)峰在前期出現(xiàn)包峰現(xiàn)象，從而影響對圖譜的判斷；反相高效液相色譜法最常應(yīng)用的流動相為乙腈與甲醇，最常應(yīng)用的固定相為十八烷基鍵合的硅膠；而查閱黃芪甲苷的紫外區(qū)吸收波長可知，其吸收波長較短，僅在200.8 nm條件下，故以乙腈作為流動相效果更佳[15]；為增加黃芪甲苷的保留時長，對流動相內(nèi)加以適當(dāng)?shù)牧姿嵴{(diào)節(jié)總體pH，并降低乙腈占比，能夠使黃芪甲苷的峰型加寬，避免雜質(zhì)峰對黃芪甲苷峰的干擾，延長了黃芪甲苷的出峰時間，且結(jié)合本次研究的圖譜可知，黃芪甲苷最終出峰處并無較大的雜質(zhì)峰，辨識度高，說明在流動相為乙腈-0.1磷酸溶液(30∶70)系統(tǒng)中，黃芪甲苷峰與雜質(zhì)峰分離效果較好。

3.3 結(jié)論 本次研究所選用的3個批號樣品，分別對其進行檢測，結(jié)果顯示，其黃芪甲苷含量差異較小，在1.20～1.30 mg/mL區(qū)間內(nèi)浮動，說明該工藝提取技術(shù)在提高黃芪甲苷提取率、縮短提取時間、防止活性成分破壞等方面具有重要的作用，且該檢驗方法提取率高，準確性高，重復(fù)性好，操作簡便，可選用并建立為該制劑的質(zhì)量控制標準。