兩種養(yǎng)殖模式水質因子及微生物群落結構研究

張雷鳴 ，原居林，倪 蒙，劉 梅，郭愛環(huán)，練青平，顧志敏*

（1.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306；2.浙江省淡水水產研究所 農業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 湖州 313001）

【研究意義】水質管理是水產養(yǎng)殖過程中十分重要的環(huán)節(jié)，是養(yǎng)殖生物賴以生存的基礎[1]，水質的優(yōu)劣受池塘水量、養(yǎng)殖生物、投喂餌料及生物代謝物等綜合因素影響。因此，保持水質健康穩(wěn)定，有效管理水質是養(yǎng)殖動物健康成長的關鍵[2]。池塘內循環(huán)流水養(yǎng)殖模式（internal-circulation pond aquaculture，IPA）是通過對養(yǎng)殖池塘進行工程化改造，形成高密度循環(huán)水養(yǎng)殖水槽和池塘生態(tài)粗養(yǎng)區(qū)相結合的新型復合養(yǎng)殖系統(tǒng)[3]。該系統(tǒng)在流水式養(yǎng)殖槽中精養(yǎng)魚類，并收集處理精養(yǎng)區(qū)產生的殘餌、糞便等固體廢棄物。同時，利用粗養(yǎng)區(qū)構建水生態(tài)處理系統(tǒng)以提高池塘自凈能力，從而維持良好水質，達到養(yǎng)殖用水循環(huán)利用。微生物群落在水域生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動過程中發(fā)揮著重要的作用，其變化與水環(huán)境因子密切相關，能一定程度的反應水體的生態(tài)環(huán)境狀況[4]。在養(yǎng)殖池塘中，微生物在有機物的分解、氮磷等營養(yǎng)元素的轉化等過程中發(fā)揮著重要的功能，病原微生物的種類和數(shù)量也直接影響著養(yǎng)殖生物的健康和收益?！厩叭搜芯窟M展】目前，對池塘微生物群落的研究已有很多，有學者分別對團頭魴（Megalobrama amblycephala）[5]、吉富羅非魚（Genetic Improvement of Farmed Tilapia）[6]、蝦蟹貝混養(yǎng)池塘[7]微生物群落結構進行研究。【本研究切入點】但目前對IPA 模式微生物群落的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以加州鱸魚（Micropterus salmoides）為研究對象，采用Illumina HiSeq2500 測序平臺分別對IPA模式和UPA 模式微生物群落進行研究，從而更全面的分析IPA 模式的水域生態(tài)環(huán)境，為該模式的水質管理調控提出指導和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗地點與實驗魚

實驗于2018 年5—12 月在浙江省湖州市某家庭農場進行，IPA 模式池塘面積20 000 m2，共有3 條長25 m×寬5 m×深2.5 m 的養(yǎng)殖槽，UPA 模式池塘面積為5 300 m2。在IPA 模式的3條養(yǎng)殖槽分別放養(yǎng)規(guī)格為（8.52±1.2）g/ind 的健康魚種25 000 尾，在UPA 模式放養(yǎng)相同規(guī)格的魚種共20 000 尾，確保單位面積667 m2養(yǎng)殖密度保持一致2 500 ind。

1.2 水樣采集和處理

從2018年5月開始對池塘的水質進行監(jiān)測，每15 d采集1次水樣，到2018年12月結束共采集11次。IPA 模式水樣采集點在每條養(yǎng)殖槽后端和生態(tài)粗養(yǎng)區(qū)，在各個采樣點用5 L 的采水器采集不同深度水樣合計15 L 的水樣混合均勻后各取250 mL 樣品；UPA 模式采用五點法采集樣品。水溫和pH 現(xiàn)場測定，其它理化指標帶回實驗室測定。另外，在每條養(yǎng)殖槽后端和傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘采取水樣，每個水樣0.5 L，立即用孔徑為0.22μm 的醋酸纖維素濾膜過濾收集水體中的微生物。將過濾好的濾膜保存在滅菌的50 mL離心管中，-20 ℃保存用于微生物宏基因組DNA的提取。

1.3 水樣微生物宏基因組DNA的提取

采用酚氯仿法提取水樣微生物宏基因組DNA，之后采用細菌基因組提取試劑盒（Solarbio，北京）的方法過柱處理。提取好的DNA 采用Nanodrop 2000（ThermoFisher，美國）測定其濃度，將合格樣品（OD260/280=1.8～2.0，濃度≥50 ng/μL，總量≥2 μg）送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Illumina HiSeq 測序平臺進行高通量測序分析，通過barcode 區(qū)分樣品序列，并對各樣本序列做QC，然后去除非特異性擴增序列及嵌合體。利用Usearch軟件RDP classifier貝葉斯算法對97%的相似度水平下的OTUs 進行生物信息統(tǒng)計分析，將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元（OTU）。根據(jù)OTUs 聚類結果，對每個OTU 的代表序列進行注釋，根據(jù)物種注釋結果，在門、綱、目、科、屬級別上生成物種相對豐度柱形累加圖。分別統(tǒng)計4個樣品中均存在的OTU，找出其核心微生物菌群（core microbiome）。同時，結合環(huán)境因素進行典范對應分析（CCA），得到顯著影響微生物群落變化的環(huán)境影響因子。結合環(huán)境因素進行CCA分析，篩選水生動物常見潛在病原微生物，得到顯著影響潛在病原微生物群落變化的環(huán)境影響因子。使用mothur計算α-多樣性指數(shù)，包括Shannon，Simpson，Chao1，ACE指數(shù)。

2 結果分析

2.1 漁獲物

結果表明，IPA模式和UPA模式在養(yǎng)殖開始時加州鱸魚的單位面積重量相同，都為168.75 kg/hm2，養(yǎng)殖結束時IPA 模式的加州鱸魚單位面積質量為12 174.5 kg/hm2，小于UPA 模式大口黑鱸養(yǎng)殖結束時的單位面積質量15 424.5 kg/hm2。

2.2 水質因子

兩個不同養(yǎng)殖模式總氮含量變化趨勢一致，9月1日開始升高，在11月1日含量達到最高，之后含量有所回落；IPA 模式總磷的含量變化比UPA 模式更穩(wěn)定，UPA 模式的總磷含量在實驗期間一直高于IPA模式，且波動較大，兩個養(yǎng)殖模式的總磷含量都是10 月15 日最高；UPA 養(yǎng)殖模式總氨氮含量一直高于IPA模式，且總氨氮含量最高值都出現(xiàn)在10月份；在養(yǎng)殖初期到9月份，UPA養(yǎng)殖模式高錳酸鹽指數(shù)含量高于IPA模式，9月份之后IPA模式含量高于UPA養(yǎng)殖模式，且兩個模式最高含量都出現(xiàn)在11月份；兩個養(yǎng)殖模式亞硝態(tài)氮含量趨勢基本一致，在10月份最高后又迅速降低回落；兩個養(yǎng)殖模式總有機碳含量變化趨勢基本一致，在10月份達到最高；養(yǎng)殖期間，IPA模式的溶氧含量一直高于UPA模式；IPA模式的pH值在養(yǎng)殖初期高于UPA模式，9月15日之后，兩模式的pH值趨向一致（圖1）。

2.3 高通量測序數(shù)據(jù)

IPA 模式和UPA 模式2 個水樣經高通量測序后共得到93765 條可用于分析的序列（total seq），包含8 137 條嵌合體序列（chimeras），9 條非靶區(qū)域序列（out target），946 條對比到細胞器組織序列以及84 673條可用于構建OTUs的處理后剩余序列（表1）。

2.4 IPA模式水體細菌群落結構特征

圖1 IPA模式養(yǎng)殖槽和UPA模式水質因子變化Fig.1 Ranges of the water quality factors in model IPA and model UPA

表1 去除嵌合體與靶區(qū)域外序列統(tǒng)計Tab.1 Elimination of chimera and target region sequence statistics

圖2表明了各樣品“門”水平的細菌群落組成情況。A1樣品優(yōu)勢菌群為放線菌門、變形菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflex）、candidate division WPS-2、厚壁菌門，相對豐度分別為25.98%、20.55%、17.78%、11.67%、11.07%、5.61%；A2 樣品優(yōu)勢菌群為酸桿菌門、變形菌門、放線菌門、厚壁菌門，相對豐度分別為29.59%、29.11%、14.88%、5.96%、5.25%。優(yōu)勢綱中A1 的第一優(yōu)勢綱為放線菌綱（Actinobacteria），其次為未確定綱（unclassified）、酸桿菌門中的Acidobacteria_Gp1綱和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），相對豐度分別為25.97%、17.69%、12.48%、10.89%；A2 的第一優(yōu)勢綱為Acidobacteria_Gp1綱，其次為放線菌綱、α-變形菌綱和未確定綱，相對豐度分別為15.05%、14.82%、13.74%、12.48。A1、A2的優(yōu)勢目除未確定目外，都為放線菌目，相對豐度為17.86%、10.02%；A1 樣品的優(yōu)勢科為未確定科（37.26%）和Acidimicrobineae_incertae_sedis 科（9.78%）；A2 樣品的優(yōu)勢科為未確定科（40.45%）和鏈霉菌科（Streptomycetaceae）（7.17%）。

圖2 兩種模式池塘水體“門”水平的細菌群落組成Fig.2 Composition of bacterial community at phylum level of pond water in mode IPA and model UPA

圖3表明了各樣品“屬”水平的細菌群落組成情況。A1、A2的優(yōu)勢屬均為未確定屬（unclassified），相對豐度分別為33.16%和29.24%；A1中WPS-2_genera_incertae_sedis、Aciditerrimonas、Gp1、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）同樣占有較大比例，其相對豐度為：11.07%、8.01%、4.47%、3.8%；而在A2 中除第一優(yōu)勢屬外，Gp1、Gp2、嗜酸鏈霉菌屬（Streptacidiphilus）、WPS-2_genera_incertae_sedis同樣占有較大比例，其相對豐度為：14.02%、5.48%、4.8%、2.07%；兩種模式中主要潛在病原微生物及其含量如表2 所示。由表2 可以看出兩種模式中潛在病原微生物種類及數(shù)量極少。

表2 兩種模式水體中潛在病原微生物種類及含量Tab.2 The difference of harmful pathogenic bacteria among model IPA and model UPA

圖3 兩種模式池塘水體“屬”水平的細菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community at genus level of pond water in mode IPA and mode UPA

2.5 水體微生物群落的多樣性分析

表3 顯示了IPA 模式和UPA 模式微生物群落多樣性狀況。結果表明，IPA 模式的Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)（1 524.74 和1 607.31）均低于UPA 模式（2 635.61 和2 723.95）；而IPA 模式Shannon 多樣性指數(shù)（6.30）高于UPA模式（5.22），IPA模式Simpson指數(shù)（0.02）高于UPA模式（0.01）。

表3 IPA模式和UPA模式水體微生物α多樣性指數(shù)Tab.3 Alpha-diversities of microorganism of pond water in model IPA and model UPA

2.6 微生物群落與環(huán)境因子的關系

圖4（a）為IPA 模式中20 個核心微生物與水質因子的CCA 排序圖。結果顯示，Aciditerrimonas（S3）、Gp1（S4）、纖線桿菌屬（S5）、Sinomonas（S6）、Thermosporothrix（S7）、Gp3屬（S8）、Tumebacillus（S9）、Blastococcus（S10）與亞硝態(tài)氮和總氨氮相關性顯著；未確定屬（S1）、WPS-2_genera_incertae_sedis（S2）等剩余優(yōu)勢屬與高錳酸鹽指數(shù)、總有機碳和總磷相關性高；；

圖4（b）為UPA模式中10個核心微生物與水質因子的CCA排序圖。結果顯示，未確定屬（Q1）、Streptacidiphilus（Q4）、Gp3（Q5）、Subdivision3_genera_incertae_sedis（Q12）、Aciditerrimonas（Q13）與高錳酸鹽指數(shù)相關性高；Gaiella（Q6）、Rhizomicrobium（Q7）、WPS-2_genera_incertae_sedis（Q8）、鞘脂單胞菌屬（Q9）、芽單胞菌屬（Q10）與總磷、亞硝態(tài)氮和總氨氮相關性高；桿菌屬（Q14）、Gp13（Q15）、大理石雕菌屬（Q16）、Nitrospirillum（Q17）、厭氧粘細菌屬（Q18）、慢生根瘤菌屬（Q19）、Spartobacteria_genera_incertae_sedis（Q20）與總氮顯著相關。

圖4 IPA模式和UPA模式微生物群落與環(huán)境因子CCA排序Fig.4 Canonical correspondence analysis of bacterial community-environmental relationship in model IPA and model UPA ditional aquaculture pond

3 結論與討論

3.1 微生物群落結構特征

在兩組水樣中，變形菌門均為優(yōu)勢菌群之一，這與李曉[5]、范立民[6]研究的羅非魚和團頭魴養(yǎng)殖池塘細菌群落結構結果一致；且本研究中變形菌門中的α-變形菌綱在IPA 模式和UPA 模式中都占有很大比例。Steven 等[8]認為，α-變形菌綱通常是湖泊和河流的主要菌群，本研究結果也證實了Steven 等的觀點。其次，對于放線菌門來說，有研究表明放線菌門是淡水浮游細菌群落中最重要的群落組成之一[9-10]，盡管目前為止對其具體的作用還知之甚少。已有的研究表明放線菌門為池塘養(yǎng)殖的重要優(yōu)勢菌群，本研究中兩種模式放線菌門的相對豐度最高在10%～20%左右，這與鄭瑤瑤[11]的池塘養(yǎng)殖草魚細菌群落研究結果一致。在兩種養(yǎng)殖模式中，UPA 模式中的酸桿菌門豐度高于IPA 模式。酸桿菌門是新進分出來的一門細菌，屬于兼性厭氧的嗜酸菌，在土壤中廣泛分布，在廢水環(huán)境中也有分布[12]。另外有研究表明，在一定范圍內，氮含量與酸桿菌多樣性呈正比，氮含量增加，酸桿菌多樣性增加[13-14]。由水質數(shù)據(jù)得知，養(yǎng)殖期間UPA 模式的總氮、氨氮含量高于IPA 模式，這可能是UPA 模式中酸桿菌門相對豐度高于IPA 模式的原因。綠彎菌門是IPA 模式中特有的優(yōu)勢門，綠彎菌門是一種能通過光合作用產生能量的微生物[15]，由前文水質和浮游植物數(shù)據(jù)得知，IPA 模式水質更加透明，浮游植物密度及生物量高于UPA 模式，光合作用的效果強于UPA模式，這可能是IPA模式中綠彎菌門成為特有優(yōu)勢門的原因。

兩種模式監(jiān)測出的50 個核心微生物（屬水平）中（圖3），共有未確定屬、Gp1、Gp2、Gp3、Aciditerrimonas、WPS-2_genera_incertae_sedis等27個共有微生物屬，說明兩種模式核心微生物屬存在較大差異，這可能受因為兩種養(yǎng)殖模式水質因子的影響。例如，嗜酸鏈霉菌屬是一鏈霉菌屬的一個新種，且常見于酸性環(huán)境中[16]，本研究UPA 模式中嗜酸鏈霉菌屬的相對豐度明顯高于IPA 模式，其原因可能是UPA 模式水體pH 值低于IPA 模式，相比IPA 模式水質偏酸，導致酸鏈霉菌屬豐度高于IPA 模式。兩種模式核心微生物中病原微生物含量極少，說明兩種養(yǎng)殖模式爆發(fā)病害的風險較低。

水體中的細菌群落的豐度和多樣性與水質環(huán)境密切相關[17]。本研究中，傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)高于IPA 模式，說明UPA 模式微生物總數(shù)量高。研究表明，Shannon 多樣性指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越低，生物多樣性越復雜。UPA 模式的Shannon 多樣性指數(shù)高于IPA 模式，Simpson 指數(shù)低于IPA 模式，說明UPA 模式的微生物群落物種多樣性更復雜。這可能是因為IPA 模式的生態(tài)粗養(yǎng)區(qū)對池塘水質凈化作用明顯，IPA模式的總氮、總磷和總氨氮指標優(yōu)于UPA模式，UPA模式水質中營養(yǎng)物質高于IPA模式，利于微生物的繁殖生長。

3.2 微生物群落和水質因子的關系

CCA 分析表明，IPA 模式核心屬中未分類屬（S1）、WPS-2_genera_incertae_sedis（S2）、Aciditerrimonas（S3）與總磷相關性高，這與汪永明[18]對淡水河流浮游細菌群落結構特征的研究結果相一致；IPA 模式核心屬中S3～S10 與亞硝態(tài)氮與總氨氮相關性顯著，UPA 模式中大部分優(yōu)勢屬與亞硝態(tài)氮相關性顯著，這與杜巖巖[19]、王雪[20]對水庫和湖泊細菌群落結構特征的研究結果相一致，這對今后IPA 模式水質和水體微生物群落的管理和調節(jié)具有指導意義。