綿羊IRS1基因CDS區(qū)克隆、序列分析及其組織表達(dá)研究

王建清，郝志云，沈繼源，王繼卿，羅玉柱，胡 江，劉 秀，李少斌

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070）

【研究意義】胰島素受體底物（insulin receptorsubstrates，IRSs）是細(xì)胞質(zhì)蛋白，在下游信號(hào)傳遞中起著重要的級(jí)聯(lián)作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前在IRSs 家族中共發(fā)現(xiàn)6 名成員，分別是IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、IRS5 和IRS6。這些蛋白質(zhì)在N 末端具有較高的同源性，有2 個(gè)極其保守的結(jié)構(gòu)域，即血小板-白細(xì)胞C激酶底物結(jié)構(gòu)域（pleckstrin homology，PH）和磷酸化酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（phosphotyrosine binding，PTB），前者負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)與磷脂相互作用，后者負(fù)責(zé)與活化受體中的NPXY 基序相互作用[1-2]。胰島素受體底物1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）是細(xì)胞胰島素反應(yīng)的主要配體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)適配蛋白，在胰島素（insulin，INS）和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（insulin-like growth factor receptor-1，IGFR-1）向細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT（Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B）和MAPK（mitogen-activated protein kinase）通路傳遞信號(hào)方面起著關(guān)鍵作用[3]。IRS1作為調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能的重要信號(hào)分子，主要調(diào)節(jié)胰島素分泌。例如，IRS1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子ATP 酶，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而激活蛋白激酶C，刺激了胰島素釋放[4]。IRS1 在生物代謝和生長(zhǎng)促進(jìn)中都發(fā)揮著重要的功能，缺乏IRS1 的小鼠表現(xiàn)出輕微的糖尿病表型和明顯的生長(zhǎng)障礙，即小鼠心臟、肝臟和腓腸肌的重量明顯減少[5]。馬向輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)IRS1基因?qū)η卮ㄅｓw尺及部分肉質(zhì)性狀有顯著的影響。此外，Porter 等[7]分析了人乳腺癌標(biāo)組織中IRS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IRS1在導(dǎo)管原位癌（DCIS)中高度表達(dá)。Jiao 等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-221 通過靶向PI3KAkt/mTOR 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因IRS1，抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。由此表明IRS1基因在乳腺發(fā)育中也具有重要的生物學(xué)功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前在GenBank中已有綿羊IRS1基因的預(yù)測(cè)序列，但尚未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)也尚未見到綿羊該基因的序列特征和mRNA 組織表達(dá)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以泌乳高峰期和空懷期的小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用克隆測(cè)序技術(shù)獲得了綿羊IRS1基因的CDS序列，通過生物信息學(xué)分析了其編碼的氨基酸序列，利用RT-qPCR 檢測(cè)了在不同乳腺發(fā)育時(shí)期，IRS1基因在乳腺、肝臟、心臟、背最長(zhǎng)肌、脾臟、肺臟、卵巢和腎臟中的表達(dá)模式，以期為闡明IRS1基因的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 綿羊組織樣的采集

在甘肅省天祝縣松山鎮(zhèn)金子河綿羊繁育場(chǎng)，選擇處于泌乳高峰期（產(chǎn)后第3周）的小尾寒羊和空懷期的小尾寒羊各3 只，所有羊只均為健康無病的3 歲母羊。現(xiàn)場(chǎng)屠宰后分別采集其乳腺、心臟、肝臟、背最長(zhǎng)肌、脾臟、肺臟、卵巢和腎臟組織，用DEPC 水沖洗干凈后裝入2 mL凍存管，然后迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 綿羊組織樣總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按照Trizol Reagent（Invitrogen，CA，USA）試劑盒說明，分別提取小尾寒羊各組織中的總RNA，用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)（NanoDrop?One）檢測(cè)所提RNA 的質(zhì)量和濃度。檢測(cè)合格的RNA 按照天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing RT kit with gDNase）的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 綿羊IRS1基因的引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

利用人IRS1基因的mRNA 序列（GenBank 登錄號(hào)為NM_005544.2），在NCBI 中BLAST 搜索綿羊基因組4.0（Ovine Genome Assembly Oar_v4.0），獲得與人IRS1mRNA高度相似的綿羊序列。用Primer 5.0設(shè)計(jì)3 對(duì)引物P1、P2 和P3，其中P1 和P2 引物用于克隆擴(kuò)增綿羊IRS1基因的CDS 全長(zhǎng)序列，引物P3 用于RTqPCR 分析，β-actin作為RT-qPCR 的內(nèi)參基因，這些引物由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司合成，引物具體序列見表1。以一只空懷期小尾寒羊的背最長(zhǎng)肌中獲得的cDNA 為模板，采用25μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：cDNA（約100 ng/μL）1μL、2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5μL、上、下游引物（0.25μmol/L）各0.5μL，加ddH2O 至25μL；PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸50 s，共37個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 綿羊IRS1基因的引物序列Tab.1 Primer sequence for sheep IRS1 gene

1.4 綿羊IRS1基因的克隆和測(cè)序

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用天根瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒純化回收目的片段，將回收的目的片段連接至pMD19-T 載體上，連接反應(yīng)體系為：0.5μL pMD19-T 載體（約50 ng）、2 μL 目的片段DNA（約150 ng）、5 μL solutionⅠ快速連接液、最后用滅菌去離子水補(bǔ)足到10 μL，16 ℃連接30 min。將連接產(chǎn)物加到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中混勻冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，取出后立即冰浴5 min，然后向其中加入500μL、37 ℃預(yù)熱的LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)45 min，吸取200 μL 菌液加到含Amp 抗生素的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將菌液均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板于37 ℃培養(yǎng)14 h。然后挑取白色單菌落加入1 mL 含Amp 抗生素的LB 培養(yǎng)基中，在220 r/min、37 ℃下培養(yǎng)10 h，用引物P1和P2分別進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增體系及條件參考1.3），對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)于檢測(cè)到目的條帶的PCR 產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的菌液，送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 綿羊IRS1基因的生物信息學(xué)分析

通過在線軟件（http：//hollywood.mit.edu/GENSCAN.html）預(yù)測(cè)綿羊IRS1基因的CDS 及其編碼的氨基酸序列，并在NCBI 中進(jìn)行Blast 驗(yàn)證；用MEGA 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam）分析綿羊IRS1的氨基酸序列特征；用在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)氨基酸序列中潛在的磷酸化位點(diǎn)；利用在線軟件（https：//string-db.org/cgi/input.pl）分析IRS1的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系；利用KEGG和GO分析其生物學(xué)功能和參與的代謝通路。

1.6 綿羊IRS1基因的表達(dá)量檢測(cè)

用SYBR Green I 嵌合熒光法，在Applied Biosystems QuantStudio?6 Flex qPCR 儀（Thermo Fisher，USA)中進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，用于檢測(cè)IRS1基因的組織表達(dá)量，然后用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。qPCR 采用20μL 反應(yīng)體系，包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL、上、下游引物（0.25μmol/L）各0.4μL、cDNA（約50 ng/μL）2μL，加ddH2O 至20μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行融解曲線分析：95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s。綿羊IRS1基因表達(dá)量檢測(cè)所用的cDNA 分別來自泌乳高峰期小尾寒羊和空懷期小尾寒羊的8 個(gè)組織，每個(gè)組織3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊IRS1基因的PCR擴(kuò)增

以小尾寒羊背最長(zhǎng)肌中獲得的cDNA 為模板，用引物P1 和P2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2 條目的條帶均接近2 000 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

圖1 綿羊IRS1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of sheep IRS1 gene PCR product

2.2 綿羊IRS1基因的克隆測(cè)序

通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物P1 和P2 擴(kuò)增的核苷酸片段大小分別為1 840 bp和1 935 bp，將這2段核苷酸序列拼接后，獲得了綿羊IRS1基因的CDS及其編碼的氨基酸序列。結(jié)果表明，該基因的CDS全長(zhǎng)3 708 bp，編碼1 235個(gè)氨基酸，這與NCBI中預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。利用BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與山羊IRS1 序列和黃牛IRS1 序列同源性分別高達(dá)99.19%和98.22%。在GenBank 中獲得山羊（XP_017914353.1）、野牦牛（XP_005890195.1）、黃牛（XP_003585821.1）、馬（XP_023498214.1）、豬（XP_020930260.1）、大鼠（NP_037101.1）、小鼠（NP_034700.2）和人類（NP_005535.1）IRS1 的氨基酸序列，結(jié)合本研究獲得的序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，本研究獲得的綿羊序列與山羊IRS1序列的親緣關(guān)系最近，其次是野牦牛和黃牛，與豬、馬和人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與小鼠和大鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖2）。以上研究結(jié)果表明，本研究獲得的核苷酸序列為綿羊的IRS1序列。

2.3 綿羊IRS1的蛋白理化性質(zhì)及其生物學(xué)功能分析

綿羊IRS1的分子式為C5615H8814N1706O1800S45，分子量為130 462.80，等電點(diǎn)為8.99，包括507個(gè)非極性氨基酸（41.1%）和728 個(gè)極性氨基酸（58.9%），其中極性氨基酸由124 個(gè)帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）（10.0%）、108個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu)（8.7%）和496個(gè)不帶電荷的氨基酸（40.2%）組成。在其氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）含量最高，占比為14.6%；其次是脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly），分別占10.7%和10.6%。綿羊IRS1 在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h，脂溶指數(shù)為56.06，平均親水性為-0.649，不穩(wěn)定指數(shù)為73.55。說明該蛋白為不穩(wěn)定的、堿性親水性蛋白。

圖2 基于IRS1的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of IRS1

綿羊IRS1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含14.01%的α螺旋、4.05%的β 轉(zhuǎn)角、67.53%的無規(guī)卷曲和14.41%的延伸鏈。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，綿羊IRS1 包含了150 個(gè)絲氨酸（Ser）、36個(gè)蘇氨酸（Thr）和18個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。GO 功能注釋顯示，IRS1基因主要參與了蛋白激酶結(jié)合及蛋白激酶C 結(jié)合等生物學(xué)過程。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，IRS1基因主要參與了PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路。String分析顯示，綿羊IRS1同IGFR1、磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（Phosphoinositide-3-Kinase Regulatory Subunit 1，PIK3R1）、絲裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-Activated Protein Kinase 8，MAPK8）、絲裂原活化蛋白激酶10（Mitogen-Activated Protein Kinase 8，MAPK10）和生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，GRB2）存在直接的相互作用（圖3）。

圖3 綿羊IRS1蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig.3 The protein interaction network of sheep IRS1

2.4 綿羊IRS1基因的組織表達(dá)特征

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，綿羊IRS1基因在小尾寒羊各組織中均表達(dá)，并且表現(xiàn)出明顯的組織特異性。無論是泌乳高峰期還是空懷期的小尾寒羊中，IRS1基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高，其次是肝臟和心臟，在肺臟、腎臟、卵巢和乳腺組織中表達(dá)量較低，在脾臟中弱表達(dá)。

同時(shí)，綿羊IRS1基因表達(dá)也表現(xiàn)出明顯的時(shí)序性。在泌乳高峰期的小尾寒羊中，IRS1基因在乳腺組織中的表達(dá)量是空懷期乳腺組織中的表達(dá)量的2.77倍（P＜0.05），但在除乳腺和脾臟以外的其他6個(gè)組織中，該基因在空懷期中的表達(dá)量均顯著高于泌乳高峰期中的表達(dá)量（P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然在泌乳高峰期中，IRS1基因的表達(dá)量在卵巢和乳腺組織間無顯著差異（P＞0.05）；但是在空懷期中，該基因在卵巢中的表達(dá)量是乳腺組織中的5.49倍（P＜0.01）（圖4）。

3 討論與結(jié)論

圖4 IRS1基因在泌乳高峰期和空懷期小尾寒羊各組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of IRS1 gene in different tissues of small-tailed han sheep during the peak-lactation and non-lactation periods

本研究利用克隆測(cè)序等實(shí)驗(yàn)方法，首次獲得了綿羊IRS1基因完整的CDS序列。該序列全長(zhǎng)3 708 bp，編碼1235 個(gè)氨基酸。綿羊IRS1 的氨基酸序列與山羊和黃牛IRS1 序列的同源性分別高達(dá)99.19%和98.22%。綿羊IRS1 的氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）含量最高（占14.6%），這與小鼠中的研究結(jié)果一致[2]。綿羊IRS1 的平均親水性為-0.649，屬于親水性蛋白。Sun 等[9]也發(fā)現(xiàn)大鼠IRS1 是相對(duì)分子質(zhì)量為131 000 的親水性蛋白質(zhì)。綿羊IRS1 的不穩(wěn)定指數(shù)為73.55，為不穩(wěn)定蛋白，但其半衰期較長(zhǎng)（30 h），這與“蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與其半衰期呈正相關(guān)”[10]的研究結(jié)果有一定出入。綿羊IRS1為不穩(wěn)定蛋白，有2 個(gè)方面的原因。一是綿羊IRS1 的氨基酸序列中含有204 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。Sprang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)磷酸化會(huì)降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。二是綿羊IRS1的不穩(wěn)定性與其二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有較少的α螺旋有關(guān)。研究表明，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋可以增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[12-13]。在綿羊IRS1的氨基酸構(gòu)成中含有高比例的脯氨酸（10.7%）和甘氨酸（10.6%），這影響了α 螺旋的形成。研究表明，不同的氨基酸序列形成α 螺旋結(jié)構(gòu)的概率不同。蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和賴氨酸都有特別高的α 螺旋形成概率，而脯氨酸和甘氨酸的α螺旋形成概率很低[14]，因?yàn)楦彼峥梢酝ㄟ^兩種途徑破壞和扭曲α螺旋，一是不能提供酰胺氫鍵，另一方面是它對(duì)α螺旋的主干進(jìn)行空間干涉，迫使α螺旋軸彎曲約30°[15]。

KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，IRS1基因主要參與了PI3K/AKT 和MAPK 信號(hào)通路，這2個(gè)信號(hào)通路都與哺乳動(dòng)物的乳腺發(fā)育和泌乳密切相關(guān)。其中PI3K/AKT 是由胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）介導(dǎo)的、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的信號(hào)通路[16]，IGF1 與IGFR1 結(jié)合后使得IRS1 發(fā)生磷酸化，磷酸化后的IRS1 與PI3K 結(jié)合生成PIP3，PIP3 可以吸引并激活A(yù)KT 激酶[17-18]，然后在mTOR 通路上促進(jìn)乳蛋白的合成[19]。MAPK 激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，MAPK 信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡，以及有絲分裂[20]。研究[5]表明，在IRS1缺失的小鼠中，PI3K/AKT 和MAPK 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到影響，并且受影響程度是組織特異性的。因此綿羊IRS1可以通過這2個(gè)信號(hào)通路調(diào)節(jié)綿羊乳腺和其它組織的發(fā)育。

蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)綿羊IRS1 同IGFR1、PIK3R1、MAPK8、MAPK10 和GRB2 存在直接的相互作用。其中IGFR1 是PI3K/AKT 信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白[21]，PIK3R1 和催化亞基（p110a、p110b 和p110d）共同構(gòu)成了PI3K[22]，IGFR1 可以通過PI3K/AKT 信號(hào)通路發(fā)揮一系列作用[17]。MAPK8（也稱為JNK1）和MAPK10（也稱為JNK3）是MAPK 激酶的JNK（c-Jun N-terminal kinases）家族成員[23]，JNK 可以與IRS1 結(jié)合，從而使IRS1 在Ser307 位點(diǎn)處發(fā)生磷酸化，最終抑制了INS 刺激的IRS1 酪氨酸磷酸化，促進(jìn)了MAPK 的激活，增強(qiáng)了MAPK 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。在INS 刺激過程中，GRB2 與IRS1 磷酸化的Y895VNI 基序結(jié)合，形成IRS1-GRB2復(fù)合物，可以增強(qiáng)INS對(duì)MAPK的刺激作用[25]。

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，綿羊IRS1基因在小尾寒羊各組織中均表達(dá)，并且表現(xiàn)出明顯的組織特異性。無論是在泌乳高峰期還是在空懷期，IRS1基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高，其次是肝臟和心臟，在肺臟、腎臟、卵巢和乳腺組織中表達(dá)量較低，在脾臟中弱表達(dá)。這與人類上的研究結(jié)果一致，張垚等[26]發(fā)現(xiàn)IRS1在全身各組織細(xì)胞中均表達(dá)，并且在骨骼肌中表達(dá)量最高。目前IRS1基因的組織表達(dá)研究集中在人類腫瘤組織中[27]，尚未有該基因在家畜組織中的研究報(bào)道。

綿羊IRS1基因也表現(xiàn)出明顯的時(shí)序表達(dá)性，在肝臟、心臟、背最長(zhǎng)肌、肺臟、卵巢和腎臟組織中，該基因在空懷期中的表達(dá)量均顯著高于泌乳高峰期中的表達(dá)量（P＜0.05），這可能與綿羊在2個(gè)時(shí)期的雌二醇分泌量差異有關(guān)。華蕊等[28]在海南黑山羊中研究發(fā)現(xiàn)，與空懷期相比，泌乳期的雌二醇分泌量顯著下降，而雌二醇可以增加IRS1mRNA的表達(dá)[29]。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IRS1基因在泌乳高峰期乳腺組織中的表達(dá)量是空懷期中的2.77倍（P＜0.05），這表明IRS1基因在促進(jìn)綿羊乳腺發(fā)育和泌乳中發(fā)揮著重要作用。研究表明在牛乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺中，INS具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和乳蛋白基因表達(dá)的作用[30-32]，而IRS1可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子ATP 酶，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而激活蛋白激酶C，刺激INS 釋放[4]。因此，IRS1 可以通過INS 的間接作用促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。此外，Chen 等[33]研究發(fā)現(xiàn)IRS1 可以通過磷酸化激活STAT5，從而參與JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控乳蛋白合成和乳腺上皮細(xì)胞分化，維持乳腺上皮細(xì)胞的存活[34-35]。

本研究首次成功克隆得到綿羊IRS1基因完整的CDS 序列，它全長(zhǎng)3 708 bp，編碼1 235 個(gè)氨基酸。IRS1在小尾寒羊各組織中廣泛表達(dá)，并且表達(dá)出明顯的組織特異性和時(shí)序特異性。