二化螟P-糖蛋白基因的克隆、序列分析及在阿維菌素處理下的表達(dá)模式

張 乾 ，潘 峰，梁建文，邱 林，丁文兵，賀華良，李有志*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省永順縣植保站，湖南 永順 416700；3.湖南省赫山區(qū)植保站，湖南 赫山 413002）

【研究意義】二化螟（Chilo suppressalis（Walker））屬鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyrlidae），廣泛分布于亞洲溫帶和亞熱帶稻區(qū)，是我國最具破壞性的水稻害蟲之一[1]?；瘜W(xué)防治是當(dāng)前防治二化螟的主要手段。阿維菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有強(qiáng)烈的殺蟲活性和高效低殘留等特點(diǎn)，是防治二化螟的理想藥劑[2]。阿維菌素作用于配體（谷氨酸、γ-氨基丁酸、組胺等）門控的氯離子通道，導(dǎo)致神經(jīng)傳遞受阻，從而使昆蟲產(chǎn)生麻痹、拒食直至死亡[3]。由于該藥劑的不合理使用，湖南、浙江等地田間二化螟種群對阿維菌素產(chǎn)生了抗性，湖南祁東等地甚至達(dá)到了高水平抗性[4-5]。因此，研究二化螟對阿維菌素產(chǎn)生抗性的機(jī)制能夠為二化螟防治和阿維菌素類藥劑的合理使用提供理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】害蟲對阿維菌素的抗性與多種解毒代謝酶有關(guān)，包括細(xì)胞色素P450 多功能氧化酶（P450s）和酯酶（CarEs）等第一階段解毒酶[6-7]，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）等二階段解毒酶[8-9]，以及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters）等第三階段藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于所有生物中，是由很多蛋白組成的一個蛋白超家族，它們介導(dǎo)無機(jī)離子、糖類、氨基酸、脂類、脂多糖、多肽、金屬、異源物質(zhì)和藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。根據(jù)ATP 保守結(jié)合域（NBDs）的序列相似性，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為ABCAABCH 8 個不同的亞家族，其中ABCB、ABCC 和ABCG 亞家族成員普遍與節(jié)肢動物的異源解毒有關(guān)[12]。【本研究切入點(diǎn)】ABCB亞家族由半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HTs）和全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FTs）組成，其中ABCB全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也被稱為P-糖蛋白（Pgp）[13]，于1976 年在耐秋水仙堿的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)[14]，P-糖蛋白基因的過表達(dá)可介導(dǎo)多藥耐藥性（MDR）。生物有機(jī)體通常具有多個P-糖蛋白基因，昆蟲的P-糖蛋白基因首先在果蠅中克隆并鑒定，果蠅至少有3 個P-糖蛋白基因，根據(jù)染色體位置分別命名為mdr49，mdr50 和mdr65[15]。目前，許多昆蟲的P-糖蛋白基因已經(jīng)被克隆和鑒定，該基因的過量表達(dá)與多種昆蟲對不同種類殺蟲劑的耐受性或抗性有關(guān)[13]。在鱗翅目昆蟲中，P-糖蛋白與小菜蛾對Cry1Ac的抗性有關(guān)[16]，與甜菜夜蛾[10]和小菜蛾[17]對阿維菌素抗性有關(guān)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究試圖探明二化螟P-糖蛋白與阿維菌素代謝和抗性之間的關(guān)系，為此克隆了該蟲兩個P-糖蛋白基因并分析其序列，進(jìn)而研究了P-糖蛋白基因在阿維菌素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

敏感種群由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)高聰芬教授惠贈；田間種群于2019年采自湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)稻田，飼養(yǎng)一代后進(jìn)行生物測定。養(yǎng)蟲室溫度（28±1）℃，光周期16L∶8D，相對濕度75%，飼料為人工飼料。

1.2 主要試劑

阿維菌素95%原藥購自浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司；RNAiso Plus、pMD18-T Vector Cloning Kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix ExTaqII 購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Axygen?AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自美國康寧公司；DEPC處理水購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物測定 使用人工飼料混毒法測定阿維菌素對敏感種群的毒力回歸曲線[18]。以丙酮為溶劑，將原藥配制成高濃度母液，然后用清水稀釋成不同濃度的藥液處理（含體積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫80）。將5 mL的阿維菌素藥液加入到45 mL 人工飼料中（40～50 ℃），混勻、凝固后，接入4 齡幼蟲。設(shè)溶劑對照和空白對照，每處理重復(fù)4次。計算處理72 h后的LC10、LC30和LC50值。

使用毛細(xì)管點(diǎn)滴法（水稻二化螟抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T 2058-2014）測定阿維菌素對田間種群的毒力回歸曲線，以丙酮為溶劑，將原藥配制成一定濃度的母液，按倍半稀釋法稀釋成不同濃度的藥液處理（含體積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫80）。將藥液點(diǎn)滴于4 齡幼蟲前胸背板上，設(shè)空白對照和溶劑對照，每個處理重復(fù)4次。計算處理72 h后的LD50值，抗性倍數(shù)=田間種群的LD50值/敏感種群的LD50值，二化螟敏感種群對阿維菌素的LD50值是0.000 17μg/蟲[5]。

1.3.2 二化螟總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成 參照RNAiso Plus 說明書，單頭提取敏感品系4 齡幼蟲總RNA，使用NanoDrop 1 000 超微量分光光度計測定RNA 的濃度和純度，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成，取1μg 提取的總RNA作為模板，反應(yīng)結(jié)束后于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 二化螟P-糖蛋白基因的克隆 結(jié)合二化螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，獲得二化螟P-糖蛋白基因片段。利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計了3對特異性引物（表1）。以合成的cDNA 第一鏈為模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系為20 μL，包括10 μL PremixTaq，1 μL cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物和7 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：98°C 2 min；98 ℃10 s，53 ℃30 s，72 ℃2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，將符合預(yù)期大小的DNA片段進(jìn)行純化回收。

純化PCR 產(chǎn)物連接到pMD18-T 載體上，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后在LB 培養(yǎng)基上（含氨芐）37 ℃過夜培養(yǎng)，使用M13通用引物檢測連接情況，連接成功的菌液委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3.4 二化螟P-糖蛋白序列分析 測序完成后，利用DNAMAN9.0 軟件進(jìn)行序列拼接，獲得二化螟CsPgp1 和CsPgp2 基因cDNA 序列，使用ORF Finder 預(yù)測開放閱讀框（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder），使用ExPASY Pro-teomic Server 進(jìn)行蛋白分子量和等電點(diǎn)預(yù)測（http://web.expasy.org/compute_pi），使用NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，使用DNAMAN9.0 軟件對二化螟P-糖蛋白氨基酸序列和其他物種的同源序列進(jìn)行比對，用MEGA7.0軟件基于鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（進(jìn)行1 000次重復(fù)分析）。

1.3.5 阿維菌素對二化螟P-糖蛋白基因表達(dá)的影響 （1）不同劑量阿維菌素處理二化螟幼蟲。為了檢測在阿維菌素處理下，二化螟CsPgp1和CsPgp2基因在轉(zhuǎn)錄水平的反應(yīng)模式，根據(jù)毒力測定結(jié)果，用阿維菌素對敏感種群四齡幼蟲72 h的LC10、LC30和LC50值進(jìn)行處理，以丙酮處理作為空白對照（CK），處理方法同本文中的生物測定方法，每個處理有4個生物學(xué)重復(fù)，分別在處理后24 h和48 h挑取活蟲液氮速凍，置于-80 ℃保存。

表1 研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

（2）不同種群幼蟲樣品收集。分別取敏感種群和田間種群四齡二化螟幼蟲樣品，每個處理4 個生物學(xué)重復(fù)，置于-80 ℃保存。

（3）總RNA的提取和cDNA的合成。分別提取不同處理的幼蟲總RNA，測定RNA濃度和純度后置于-80 ℃保存。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成二化螟cDNA，cDNA于-20 ℃保存。

（4）實(shí)時定量分析。根據(jù)克隆獲得的兩個P-糖蛋白基因cDNA 序列，使用Primer-BLAST 分別設(shè)計qPCR 引物，以EF-1α作為內(nèi)參基因[19]，引物信息見表1。PCR 擴(kuò)增體系為10μL，包括5μL 2×TB Green Premix ExTaqII，1μL cDNA，0.4μL 上游引物，0.4μL 下游引物和3.2μL ddH2O，在CFX96 Touch 熒光定量PCR儀選用兩步法程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Bio-Rad CFX Maestro 1.1 軟件分析qRT-PCR 數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法計算P-糖蛋白基因的相對表達(dá)量，不同處理和不同種群P-糖蛋白基因的表達(dá)量使用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA）（P＜0.05），使用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿維菌素對二化螟毒力

阿維菌素對敏感種群72 h 的LC10、LC30和LC50值分別為0.004，0.010，0.017 mg/L，阿維菌素對田間種群72 h 的LD50值為0.010 54 μg/蟲，抗性倍數(shù)為62 倍，為中等抗性水平，在隨后的實(shí)驗中，分別用LC10、LC30和LC50濃度的阿維菌素處理二化螟敏感種群4齡幼蟲。

2.2 二化螟P-糖蛋白基因cDNA的克隆和序列分析

克隆獲得二化螟CsPgp1 和CsPgp2 基因的cDNA 序列，開放閱讀框全長分別為3 780 bp 和3 939 bp，分別編碼1 259 和1 312 個氨基酸（圖1），預(yù)測分子量分別為137 ku 和144 ku，等電點(diǎn)分別為6.58 和8.52。使用NCBI CDD 和SMART 分析發(fā)現(xiàn)CsPgp1 和CsPgp2 均由兩個相似的部分構(gòu)成，每個部分包含一個跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD）和一個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domain，NBD），從蛋白N 端到C 端形成了TMD-NBD-TMD-NBD 結(jié)構(gòu)，這是完整的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白經(jīng)典結(jié)構(gòu)（圖1、圖2）。CsPgp1 的跨膜結(jié)構(gòu)域包含12 個跨膜螺旋區(qū)域（TM），CsPgp2 的跨膜結(jié)構(gòu)域包含11 個TM；每個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域都攜帶有ATP 結(jié)合位點(diǎn)，ABC 典型結(jié)構(gòu)，Walker A，Walker B，D 環(huán)，Q 環(huán)和H 環(huán)等標(biāo)簽序列（圖2、圖3）。

綜上所述，文化因素、社會因素、個人因素與少數(shù)民族大學(xué)生創(chuàng)業(yè)能力均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，對其創(chuàng)業(yè)能力的提升都起著重要作用，這為少數(shù)民族大學(xué)生創(chuàng)業(yè)能力的有效提升提供了參考價值。

圖1 二化螟CsPgp1（A）和CsPgp2（B）的核苷酸序列及預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CsPgp1 and CsPgp2 from Chilo suppressalis

圖2 CsPgp1（A）和CsPgp2（B）蛋白的一級和二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic drawing of the primary and secondary structures of CsPgp1（A）and CsPgp2（B）

2.3 二化螟P-糖蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用CsPgp1和CsPgp2的氨基酸序列和其他物種的同源序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果表明，P-糖蛋白與其他昆蟲的多藥耐藥性蛋白有很高的相似性，其中CsPgp1 與亞洲玉米螟Ostrinia furnacalisMDR1（XP_028158084.1）的關(guān)系最近，一致性為77%，與小菜蛾P(guān)lutella xylostellaPgp（QDY92632.1）、家蠶Bombyx moriMDR1（XP_021202653.1）和黑腹果蠅Drosophila melanogasterMDR50（NP_523740.3）氨基酸序列一致性分別為73%、72%和44%。CsPgp2 與亞洲玉米螟O.furnacalisMDR49-like（XP_028159924.1）的關(guān)系最近，一致性為81%，與粉紋夜蛾Trichoplusia niMDR3（ADV76539.1）、家蠶B.moriMDR49（XP_004929922.1）和黑腹果蠅D.melanogasterMDR49（AAA28679.1）氨基酸序列一致性分別為78%、76%和43%，CsPgp1和CsPgp2分別對應(yīng)黑腹果蠅的mdr50和mdr49兩個P-糖蛋白。

使用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果顯示，二化螟CsPgp1 和CsPgp2 聚為不同的兩支，表明這兩個基因可能具有不同的進(jìn)化模式，但二者都和鱗翅目昆蟲的P-糖蛋白（或MDR）聚為一支，說明二化螟CsPgp1和CsPgp2具有高度的進(jìn)化保守性。此外，還可以看出二化螟與亞洲玉米螟的親緣關(guān)系最近，其他目的昆蟲各自聚成小類群也說明了P-糖蛋白在進(jìn)化上具有很高的保守性。

圖3 CsPgp1（A）和CsPgp2（B）氨基酸序列與其他物種比對Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of CsPgp1（A）and CsPgp2（B）subunits with other species

圖4 二化螟CsPgp1和CsPgp2與其他物種P-糖蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Molecular phylogenetic analysis of CsPgp1 and CsPgp2 along with other organism Pgps

2.4 阿維菌素處理下二化螟P-糖蛋白基因的表達(dá)模式

2.4.1 阿維菌素臨時刺激對二化螟P-糖蛋白基因表達(dá)量的影響 不同劑量阿維菌素處理二化螟4齡幼蟲后不同時間點(diǎn)CsPgp1 的轉(zhuǎn)錄水平如圖5A 所示，與對照組相比，處理24 h，各處理組的CsPgp1 表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對照組的1.97 倍、2.18 倍、1.87 倍，LC30處理組的CsPgp1 表達(dá)量顯著高于LC50處理組（P＜0.05）；處理48 h，LC10處理組的CsPgp1 表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），為對照組的1.28 倍，LC30和LC50處理組的CsPgp1表達(dá)量與對照組差異不顯著。

不同劑量阿維菌素處理二化螟4齡幼蟲后不同時間點(diǎn)CsPgp2的轉(zhuǎn)錄水平如圖5B 所示，與對照組相比，處理24 h，各處理組的CsPgp2 表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對照組的3.23 倍、1.87 倍、2.12 倍，LC10處理組的CsPgp2 表達(dá)量顯著高于LC30和LC50處理組（P＜0.05）；處理48 h，各處理組的CsPgp2 表達(dá)量與對照組差異不顯著。

2.4.2 二化螟P-糖蛋白在不同種群中mRNA 相對表達(dá)量的差異 敏感和田間種群的P-糖蛋白相對表達(dá)量如圖6所示，田間種群的CsPgp1和CsPgp2表達(dá)量均顯著高于敏感種群（P＜0.05），分別是敏感種群的3.01倍和2.39倍。

圖5 阿維菌素處理下二化螟4齡幼蟲CsPgp1（A）和CsPgp2（B）的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of CsPgp1（A）and CsPgp2（B）mRNA in 4th instar larval of Chilo suppressalis treated with abamectin

3 結(jié)論與討論

害蟲對殺蟲劑的抗性是由不同的機(jī)制引起的，包括行為的改變，降低殺蟲劑對表皮的穿透性，殺蟲劑作用靶標(biāo)位點(diǎn)的突變和解毒代謝酶介導(dǎo)的代謝抗性等[6-9]。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類第三級藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已有報道[12]顯示其與27 種不同的殺蟲劑（殺螨劑）的轉(zhuǎn)運(yùn)或抗性有關(guān)。P-糖蛋白是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員，具有非特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，從而使昆蟲對殺蟲劑等產(chǎn)生抗性或耐受性[13]。近年來，阿維菌素廣泛用于我國水稻種植區(qū)進(jìn)行二化螟的防治，通過對二化螟抗藥性的持續(xù)監(jiān)測，2015 年湖南祁東等地田間種群已經(jīng)對阿維菌素產(chǎn)生了高水平抗性[4]?，F(xiàn)已在多種昆蟲中證實(shí)P-糖蛋白介導(dǎo)了對阿維菌素和Bt蛋白的抗性[3,10,16-17]，因此，研究P-糖蛋白與二化螟對阿維菌素抗性之間的關(guān)系具有重要的意義。

阿維菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯的阿維菌素亞家族，已被廣泛用于鱗翅目害蟲的防治。目前，關(guān)于二化螟對阿維菌素抗性的研究主要在阿維菌素的受體基因，研究表明RNA 干擾二化螟GABA 受體基因的兩個亞基CsRDL1和CsRDL2，幼蟲對阿維菌素的敏感性顯著降低[19]；二化螟GluCl基因有3個可變剪接體（CsGlu-Cl A、CsGluCl B和CsGluCl C），RNA 干擾結(jié)果表明沉默該基因能夠顯著增加幼蟲對阿維菌素的敏感性[21]。本研究中在不同濃度阿維菌素的臨時刺激下，二化螟CsPgp1 和CsPgp2 的表達(dá)量在24 h 顯著上調(diào)，表明這兩個基因?qū)Π⒕S菌素均存在應(yīng)激反應(yīng)，可能是因為這兩個基因均參與了阿維菌素在二化螟體內(nèi)的代謝。兩項相似的研究表明小菜蛾的1個P-糖蛋白和朱砂葉螨的兩個P-糖蛋白基因同樣能夠在阿維菌素的誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)[3,17]。與24 h相比，各處理組的CsPgp1和CsPgp2在48 h表達(dá)下降，表明二化螟P-糖蛋白在阿維菌素的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出時間效應(yīng)，誘導(dǎo)的P-糖蛋白高表達(dá)可能參與阿維菌素的代謝過程。處理24 h，LC30處理組的CsPgp1 表達(dá)量顯著高于LC50處理組，LC10處理組的CsPgp2 表達(dá)量顯著高于另外兩種濃度處理，表明對于不同濃度的阿維菌素，P-糖蛋白的耐受水平也會不一樣，在棉鈴蟲中也存在類似的結(jié)果[22]。

本研究檢測了二化螟敏感種群和田間抗性種群（62 倍）P-糖蛋白基因的表達(dá)差異，結(jié)果顯示田間抗性種群的CsPgp1 和CsPgp2 的表達(dá)量均顯著高于敏感種群。許多昆蟲的P-糖蛋白基因在抗性種群中高表達(dá)，如阿維菌素抗性的小菜蛾P(guān)-糖蛋白基因表達(dá)量顯著高于敏感種群[17]。所以P-糖蛋白可能參與了二化螟對阿維菌素的代謝，從而產(chǎn)生抗性或耐受性。此外，本研究中采用的二化螟抗性種群為田間種群，田間種群用藥歷史復(fù)雜，抗性發(fā)展機(jī)制會有所不同。因此只能間接反映阿維菌素抗性水平高低與P-糖蛋白基因的表達(dá)量存在一定的聯(lián)系，在二斑葉螨的研究中也有類似報道[2]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白基因在二化螟田間抗性種群和臨時阿維菌素處理的敏感種群中均表達(dá)上調(diào)，推測其可能參與了二化螟對阿維菌素的代謝，可能與二化螟對阿維菌素抗性有關(guān)。這些結(jié)果為研究二化螟對阿維菌素抗性與P-糖蛋白之間的關(guān)系提供了參考。近年來，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為研究昆蟲體內(nèi)基因功能的有力工具[23]，Guo等[24]通過敲除小菜蛾ABCC2和ABCC3基因驗證了其在小菜蛾對Cry1Ac 抗性中的作用。下一步可以通過CRISPR/Cas9 技術(shù)對P-糖蛋白的功能進(jìn)行驗證，進(jìn)一步研究P-糖蛋白與二化螟抗藥性之間的關(guān)系。