廣東省屠宰場(chǎng)豬群PRRSV感染狀況調(diào)查及基因測(cè)序分析

許秀瓊，查云峰，王福廣，劉 劼，吳立煬，葉 建，孫彥偉

（1.廣西大學(xué)，廣西南寧 530000；2.廣東省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510230）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，以及各年齡段豬群出現(xiàn)持續(xù)性高熱和呼吸道癥狀[1]。PRRSV 分為美洲型和歐洲型兩種基因型，其中美洲型代表毒株為VR2332 毒株，歐洲型為L(zhǎng)elystad virus（LV）毒株[2]，兩者基因差異較大，核苷酸同源性為50%～60%[3]。最近關(guān)于我國(guó)歐洲型 PRRSV 的報(bào)道逐漸增多，而其遺傳多樣性依然未知。PRRSVORF5基因編碼的病毒糖基化囊膜蛋白GP5，是PRRSV 中變異程度最大的結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4-5]，因此ORF5基因序列可在一定程度上反映出PRRSV 的遺傳變異情況[8]。本研究對(duì)2019年廣東省部分地區(qū)43 個(gè)屠宰場(chǎng)采集到的840 份豬淋巴結(jié)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)，了解屠宰場(chǎng)豬群的PRRSV 隱性帶毒情況。此外，選取部分PRRSV 陽性樣品進(jìn)行ORF5基因擴(kuò)增測(cè)序，以及核苷酸同源性分析和遺傳進(jìn)化分析，了解該地區(qū)的PRRSV 遺傳變異情況，以期為有效防控PRRS 提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

樣品來源于2019年廣東省21 個(gè)市的43 個(gè)生豬屠宰場(chǎng)；每個(gè)屠宰場(chǎng)隨機(jī)抽取10～20 頭臨床健康豬，無菌采集淋巴組織，-20 ℃保存，共采集淋巴結(jié)樣品840 份。

1.2 試劑

DEPC water、50×TAE、PermixTaq（ExTaqVersion 2.0 plus dye）、Oligo dT Primers、Reverse Transcriptase（M-MLV）、Random Primers、Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、DL 2000 DNA Marker，購自大連寶生生物公司；氨芐磁珠法核酸提取試劑盒，購自Thermo 公司；PRRSV通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒和PRRSV 歐洲株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司。

1.3 儀器

熒光PCR 儀（羅氏，Light Cycler 480 Ⅱ）；全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)（Thermo，KingFisher Flex）；高速冷凍離心機(jī)（eppendorf，5424R）；超凈工作臺(tái)（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，BBS-V 1300）；生物安全柜（Thermo，F(xiàn)orna 149）；組織勻漿儀（羅氏，MagNA Lyser）；小型高速離心機(jī)（湘儀，H1650-W）；旋渦震蕩儀（IKA，MS3）；凝膠成像系統(tǒng)（Protein Simple，Alphalmager HP）；電泳儀（北京六一，DYY-6C）。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) GenBank 中收錄的分離自我國(guó)的PRRSV全基因組序列，選擇保守區(qū)域，利用Oligo7.0 設(shè)計(jì)3 對(duì)檢測(cè)引物（表1）。引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 本研究設(shè)計(jì)和采用的引物

1.5 核酸提取

按照氨芐磁珠法核酸提取試劑盒和KingFisher Flex 全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)的使用方法進(jìn)行RNA 抽提，抽提產(chǎn)物用于后續(xù)RT-PCR 檢測(cè)。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)

嚴(yán)格按照PRRSV 通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒和PRRSV 歐洲株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

將各地區(qū)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)陽性的核酸樣品進(jìn)行普通RT-PCR 檢測(cè)，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，將觀察到的目的條帶進(jìn)行切膠回收，純化樣品，送測(cè)序，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)

熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，廣東省不同區(qū)域屠宰場(chǎng)均有不同程度的美洲型PRRSV 和歐洲型PRRSV 核酸陽性被檢出。在采集的840 份淋巴組織中，PRRSV 陽性檢出率為17.02%，其中美洲型為14.29%，歐洲型為2.73%；粵東、粵北、粵西和珠三角地區(qū)美洲型陽性檢出率分別為7.50%、13.13%、6.88%、21.11%，歐洲型分別為1.25%、0.63%、0.63%、5.28%。

2.2 ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析

將熒光RT-PCR 檢測(cè)陽性的核酸樣品進(jìn)行普通RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，成功擴(kuò)增到15 個(gè)陽性樣品。將這15 個(gè)目的條帶純化、測(cè)序，截取ORF5序列信息進(jìn)行分析。在GeneBank 上選取PRRSV 參考毒株與2019年測(cè)得的ORF5序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果如圖1 所示。采用NJ 法MEGA6，自舉檢驗(yàn)值為1 000。從遺傳進(jìn)化樹上可以看出，有3株毒株為歐洲型，12 株毒株為美洲型。而美洲型毒株中，有5 株處于以JXA1 為代表毒株的分支上，2 株處于以VR2332 為代表毒株的分支上，2 株處于以NADC30 為代表毒株的分支上，3 株處于以GM2 為代表毒株的分支上，沒有檢測(cè)到以CH1-a和NT1 為代表毒株分支的毒株。

圖1 PRRSV ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.3 ORF5 基因核苷酸同源性分析

從 圖2 可以看出，檢測(cè)到的3 株 歐洲型毒株ORF5基因間的核苷酸相似度為90.2%～92.4%，與LV 株ORF5基因的核苷酸相似度為86.9%～88.2%。檢測(cè)到的12 株美洲型毒株ORF5基因間的核苷酸相似度為87.5%～99.6%，各分支毒株與其所屬分支的代表毒株JXA1、VR2332、NADC30、GM2 的ORF5基因間的核苷酸相似度分別為98.4%～99.4%、99.1%～99.3%、95.7%～96.6%、92.6%～94.7%。

2.4 GP5 蛋白氨基酸變異分析

圖2 PRRSV ORF5 基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖3 PRRSV GP5 氨基酸位點(diǎn)變異分析結(jié)果

以VR2332 為標(biāo)準(zhǔn)毒株，對(duì)檢測(cè)到的12 株美洲型PRRSV 的GP5 蛋白信號(hào)肽、誘導(dǎo)表位、第一高變區(qū)、中和表位、第二高變區(qū)、跨膜區(qū)及細(xì)胞表位進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)變異分析。由圖3 可以看出，大部分檢測(cè)毒株信號(hào)肽區(qū)發(fā)生第3位（由E突變?yōu)镚）、第11 位（由Y 突變?yōu)镃）、第16 位（由S 突變?yōu)镕）等氨基酸位點(diǎn)變異；誘導(dǎo)表位中，有3 株毒株發(fā)生1 個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，1 株發(fā)生2 個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異；高變區(qū)中，氨基酸變異位點(diǎn)較多，但也有1 株毒株沒有發(fā)生變異；中和表位中，第38 位氨基酸有3 株毒株由H 突變?yōu)閅，第39 位有5 株毒株由L 突變?yōu)镮、2 株突變?yōu)镾、1 株突變?yōu)門；跨膜區(qū)主要發(fā)生第66 位（由S 突變?yōu)門/C）、第101 位（由F 突變?yōu)閅）、第102 位（由V 突變?yōu)閅/H/R）等氨基酸位點(diǎn)變異；細(xì)胞表位的變異主要有第121、127、161、185、189、200 位等氨基酸位點(diǎn)的變異。第13 位和151 位氨基酸是與毒力相關(guān)的位點(diǎn)，其中：第13 位點(diǎn)中，有3 株為Q，9 株由Q 突變?yōu)镽；第151 位點(diǎn)中，有8 株為R，4 株由R 突變?yōu)镵。

3 討論

PRRSV 1987年首次在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)[6]，隨后在世界主要養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)廣泛傳播。1996年我國(guó)首次檢測(cè)到PRRSV，證明了PRRSV 在豬群中的存在。2006年出現(xiàn)的高致病性PRRSV 毒株使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)遭到重創(chuàng)[7]。2013年出現(xiàn)新的PRRSV 變異株NADC30-Like 毒株[8]，使得我國(guó)的PRRSV 流行更加多樣化，防控更加復(fù)雜化。盡管目前國(guó)內(nèi)采取了PRRSV 疫苗免疫等防控措施，使得PRRSV流行強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，但PRRSV 仍然影響著養(yǎng)豬業(yè)。PRRSV 可引起持續(xù)性感染，病毒血癥期可持續(xù)6～7 周，甚至長(zhǎng)達(dá)16 個(gè)月。PRRSV 活疫苗（JXA1-R 株）免疫后在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，60 d后基本為陰性[8]。疫苗毒株與臨床PRRSV 毒株在傳播方式、存留時(shí)間等方面均具有相似特點(diǎn)，如在皮膚破損的情況下，易經(jīng)胃腸道外途徑感染，從而將疫苗病毒傳播給非免疫豬，持續(xù)散播疫苗病毒，使其在豬群中循環(huán)存在。育肥豬是PRRSV 的主要攜帶者之一，是PRRSV 的重要傳染源。因此，亟需落實(shí)與強(qiáng)化規(guī)?；i場(chǎng)生物安全措施，繼續(xù)推動(dòng)PRRSV 的凈化工作。

目前，我國(guó)PRRSV 呈現(xiàn)多種亞型共存的局面，近年來，除檢測(cè)到美洲型PRRSV 以外，也檢測(cè)到了歐洲型PRRSV。1997年北京市首次發(fā)現(xiàn)并鑒定我國(guó)最早的歐洲型PRRSV B13 株[9]，接著2006年和2013—2014年福建省發(fā)現(xiàn)[10]，2007年浙江省發(fā)現(xiàn)[11]，2010年香港發(fā)現(xiàn)[12]，2011年貴州省發(fā)現(xiàn)[13]，2012 遼寧省發(fā)現(xiàn)[14]；2016—2018年黑龍江省、河南省先后發(fā)現(xiàn)[15]，說明歐洲型PRRSV 呈現(xiàn)擴(kuò)散流行趨勢(shì)。本研究通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，來自屠宰場(chǎng)的臨床健康屠宰生豬中，仍然存在一定比例的隱性感染或帶毒情況，其中美洲型PRRSV 陽性率為14.29%，歐洲型為2.73%。雖然歐洲型毒株的檢出率不高，但建議引起重視。盡管已報(bào)道的國(guó)內(nèi)歐洲型PRRSV 致病力較低，尚未對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來較大影響，但感染后會(huì)增加繼發(fā)感染其他病原的概率。此外，歐洲型PRRSV 在我國(guó)暫無疫苗保護(hù)，而我國(guó)歐洲型PRRSV 的檢出率逐年增高，因此加大對(duì)歐洲型PRRSV 的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)于控制其流行具有重要意義。

對(duì)檢測(cè)到的15 株P(guān)RRSVORF5基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其在以JXA1、VR2332、NADC30、GM2、LV 株為代表毒株的分支上均有分布，說明在廣東省屠宰豬群中攜帶的PRRSV 類型比較復(fù)雜，其中有5 株毒株屬于JXA1 分支毒株，占比達(dá)到33.33%，說明流行毒株以高致病性毒株為主。檢測(cè)到的3 株歐洲毒株與LV 毒株ORF5基因間的核苷酸同源性為86.9%～88.2%，遺傳變異較大，應(yīng)謹(jǐn)防遺傳變異引起PRRSV 毒力增強(qiáng)帶來的危害。通過GP5 蛋白氨基酸變異分析發(fā)現(xiàn)，蛋白信號(hào)肽、中和表位和3 個(gè)細(xì)胞表位區(qū)域存在較多的氨基酸變異。其中：中和表位中，有5 株毒株發(fā)生L39I突變，2株發(fā)生L39S突變，1株發(fā)生L39T突變。這些突變有可能會(huì)對(duì)GP5 蛋白的免疫原性造成一定影響，從而影響疫苗的免疫效果，導(dǎo)致免疫失敗。另外，與毒力有關(guān)的第13 位和第151 位氨基酸位點(diǎn)中，有9 株毒株發(fā)生Q13R 突變，有4 株發(fā)生R151K 突變。這有可能會(huì)引起毒力增強(qiáng)，出現(xiàn)新的高致病性毒株。

本次試驗(yàn)樣品采自廣東省21 個(gè)市的屠宰場(chǎng)，大部分生豬來源于廣東本地，部分生豬由外省調(diào)入?？偟膩碚f，廣東省屠宰豬群中PRRSV 攜帶率較高，血清型復(fù)雜，歐洲型和美洲型都有，部分毒株遺傳變異大。這從側(cè)面反映出PRRSV 在各地養(yǎng)殖場(chǎng)中的流行依然較嚴(yán)重。建議豬場(chǎng)嚴(yán)格生物安全措施，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，繼續(xù)推動(dòng)種豬場(chǎng)PRRSV 的凈化工作。