重金屬鎘對銅綠微囊藻的分層胞外聚合物淬滅機(jī)制研究

王 奇，葛姝潔，于恒國，趙 敏，汪德進(jìn)，王傳花*

（1.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035；2.浙江省水環(huán)境與海洋生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州325035；3.安慶師范大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，安徽安慶246133）

環(huán)境介質(zhì)中鎘的來源主要包括電鍍、冶煉、合金制造、塑料、電池和采礦等[1]。隨著現(xiàn)代工業(yè)迅猛發(fā)展，受污染環(huán)境中鎘的含量也逐年上升，很多飲用水源地也發(fā)現(xiàn)鎘所致的健康風(fēng)險，如黔江區(qū)9個飲用水源地、湘江流域、珠江流域、長江下游、太湖等，都受到了不同程度的鎘污染[2]。飲用水源地的富營養(yǎng)化問題同樣不容樂觀，據(jù)2014年中國水資源公報[3]，我國的119個主要湖泊和646座主要水庫富營養(yǎng)化比例分別高達(dá)69.8%和41.95%，由此引發(fā)藻類水華的頻繁暴發(fā)。形成“水華”的藻類主要是藍(lán)藻門中的微囊藻、束絲藻等，藻細(xì)胞內(nèi)分泌、新陳代謝等過程中分泌產(chǎn)生的生物大分子聚合物稱為藻類胞外聚合物（EPS）。EPS主要由蛋白質(zhì)和多糖以及少量的核酸、脂類和氨基酸等成分組成[4]。EPS結(jié)構(gòu)特殊，會影響細(xì)胞表面特性以及對污染物的吸附性能[5]。

鎘在水環(huán)境中易被膠體顆粒和藻類富集[6-7]，Cd（Ⅱ）會影響藻類EPS的成分，有文獻(xiàn)報道EPS與As（III）存在熒光淬滅作用[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取典型水華藍(lán)藻中的兩種銅綠微囊藻（產(chǎn)毒株FACHB-905和不產(chǎn)毒株FACHB-469）為實(shí)驗(yàn)對象，通過三維熒光光譜法研究兩者的分層EPS差異及Cd（Ⅱ）對EPS的淬滅作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

（1）儀器。F-4600三維熒光光譜儀（日本日立公司），CR22N型高速冷凍離心機(jī)（日本日立），MS-HPRO型恒溫磁力攪拌器（大龍創(chuàng)興），SB-5200DTS型超聲波雙頻清洗機(jī)（寧波新芝），BIO-RAD680 型酶標(biāo)儀（美國Bio-rad），TU1810PC型紫外可見分光光度計（北京普析通用），PE-AAnalyst?800原子吸收分光光度計（美國PerkinElmer）。

（2）藻類分層EPS 的提取。銅綠微囊藻產(chǎn)毒株FACHB-905和不產(chǎn)毒株FACHB-469，均購于中國科學(xué)院淡水藻種庫。采用弱堿-熱浴法[9]提取藻類分層EPS。EPS提取前測得兩種藻的藻密度均為1×1010個/L，生物量均約為0.5 g/L。將藻樣在4 ℃下以轉(zhuǎn)速3 890 r/min離心操作15 min，取上層清液為粘液層（SL-EPS）；殘余物重懸浮于0.05%的NaCl緩沖液中，在4 ℃下以轉(zhuǎn)速5 220 r/min離心操作15 min，取上清液為松散附著型胞外聚合物（LB-EPS）；繼續(xù)將殘余物重懸浮于0.05%的NaCl 緩沖液中，用40%的NaOH 溶液，將樣品pH 調(diào)節(jié)至9.0，平衡10 min 后將樣品置于60 ℃恒溫水浴30 min。取出，待冷卻后在4 ℃下以轉(zhuǎn)速9 520 r/min離心操作15 min，收集上清液為緊密附著型胞外聚合物（TB-EPS）。所有分層EPS經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素膜過濾，經(jīng)透析袋透析純化48 h后（遮光，4 ℃），置于棕色瓶中于4 ℃冰箱冷藏保存，實(shí)驗(yàn)在一周內(nèi)完成。

（3）分層EPS中多糖和蛋白質(zhì)的測定。采用蒽酮硫酸法[10]和BCA法[11]分別測分層EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量。

（4）分層EPS與Cd（Ⅱ）的熒光淬滅滴定。三維熒光光譜以氙燈為激發(fā)光源，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為200 nm ～500 nm和250 nm ～600 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫分別設(shè)為5 nm和2 nm；掃描速度為12 000 nm·min-1，控制溫度為（298 ±1）K。向裝有1.5 mL EPS溶液的分子熒光石英比色皿中加入Cd（Ⅱ）溶液并用磁力攪拌器攪拌4 min后重復(fù)測量3次熒光強(qiáng)度，取平均值，所有實(shí)驗(yàn)均利用超純水做空白對比。

（5）數(shù)學(xué)模型分析。采用Stern-Volmer方程[12]和修正Stern-Volmer方程[13]以及修正Hill方程[14]來計算結(jié)合常數(shù)等相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種銅綠微囊藻分層EPS的組分比較

由圖1 可知，兩種藻的分層EPS中各組分含量存在一定差異。FACHB-905分層EPS中多糖含量均高于蛋白質(zhì)，而FACHB-469除SL-EPS中多糖含量明顯高于蛋白質(zhì)外，LB/TB-EPS中蛋白質(zhì)含量均略高于多糖?？梢奆ACHB-469 中有機(jī)組分總含量高于FACHB-905；且各組分含量從大到小依次為SL-EPS、TB-EPS、LB-EPS。同時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ACHB-469 中蛋白質(zhì)含量明顯高于FACHB-905（除LB-EPS 外）；多糖含量除SL-EPS 明顯高于 FACHB-905 外，其他層 EPS 的多糖含量均低于FACHB-905。支田田[15]等研究表明，藻類去除水體中的重金屬等有毒污染物，主要是其細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)和多糖形成糖蛋白，捕捉水體中重金屬等有毒污染物。因此，兩種藻類分層EPS中各組分含量的差異性表明其與Cd（Ⅱ）之間的相互作用可能也存在較大的差異。

圖1 兩種藻類分層EPS中有機(jī)組分的含量

2.2 兩種銅綠微囊藻分層EPS的熒光特性

兩種銅綠微囊藻分層EPS熒光光譜如圖2所示。從熒光光譜圖2（a）、（c）發(fā)現(xiàn)：兩種藻在SL-EPS和LB-EPS 中的熒光團(tuán)基本一致，SL-EPS 中都含有3 個熒光峰（峰A 為色氨酸Ex/Em=275 nm～280 nm/328 nm～338 nm；峰B 為類腐殖酸，Ex/Em=255 nm～260 nm/440 nm～452 nm；峰C 為類腐殖酸，Ex/Em=325 nm～335 nm/390 nm～410 nm）；LB-EPS 中都含有2 個熒光峰（峰A 為色氨酸，Ex/Em=275 nm～280 nm/322 nm～332 nm；峰B 為芳香類蛋白Ⅰ，Ex/Em=225 nm～230 nm/310 nm～330 nm）。而TB-EPS 的熒光團(tuán)有所差異：FACHB-905含有與LB-EPS相同的2個熒光峰，峰A色氨酸和峰B芳香類蛋白Ⅰ；FACHB-469除含有峰A 和峰B 外還有2 個均為類腐殖酸的熒光峰（峰C：Ex/Em=355 nm～360 nm/440 nm～442 nm；峰D：Ex/Em=270 nm/438 nm～444 nm）。同時還發(fā)現(xiàn)兩種藻LB-EPS 中兩個熒光峰的熒光強(qiáng)度明顯低于SLEPS和LB-EPS，這可能與LB-EPS中蛋白質(zhì)和多糖的含量明顯低于其他兩層EPS相關(guān)。從圖2（b）、（d）可知，在兩種藻的分層EPS中，Cd（Ⅱ）對熒光峰A的淬滅效果并不明顯；對SL-EPS中熒光峰B、C有一定淬滅效果；LB-EPS 和TB-EPS 中熒光峰B 的淬滅效果十分明顯，說明藍(lán)藻EPS 中的芳香類蛋白Ⅰ與Cd（Ⅱ）相互作用能力最強(qiáng)。值得注意的是，F(xiàn)ACHB-469的TB-EPS在加入Cd（Ⅱ）后，熒光峰C、D的熒光強(qiáng)度反而有所增強(qiáng)，且出現(xiàn)新的產(chǎn)熒光基團(tuán)（峰E為類富里酸：Ex/Em=240 nm/442 nm～448 nm）。

2.3 熒光淬滅機(jī)制研究

不同溫度下，隨著Cd（Ⅱ）濃度增加，兩種藍(lán)藻分層EPS中不同熒光峰的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)不同的變化趨勢，如圖3所示。

在FACHB-905分層EPS中，峰A的熒光強(qiáng)度減弱均不明顯；SL-EPS中峰B、C的熒光強(qiáng)度減弱比較明顯；TB-EPS中峰B熒光強(qiáng)度減弱十分明顯，說明FACHB-905緊密型EPS中芳香類蛋白Ⅰ與Cd（Ⅱ）反應(yīng)更強(qiáng)烈，且峰B的減弱程度TB-EPS的大于LB-EPS。同時也發(fā)現(xiàn)：LB-EPS和TB-EPS中峰B的熒光減弱趨勢隨溫度升高而加強(qiáng)，而SL-EPS 中峰B、C 的熒光減弱趨勢則在288 K 下最明顯，這說明FACHB-905最外層黏液層SL-EPS中的有些類腐殖酸基團(tuán)主要在低溫下被Cd（Ⅱ）淬滅，且峰C的淬滅效果比峰B更強(qiáng)。SL-EPS中熒光峰A只在288 K下被Cd（Ⅱ）淬滅，高于288 K，與Cd（Ⅱ）反應(yīng)不明顯。

在FACHB-469分層EPS中，SL-EPS中峰B、C的熒光減弱趨勢隨溫度增加而加強(qiáng)，這與FACHB-905的結(jié)果相反，且FACHB-469的TB-EPS在加入Cd（Ⅱ）后，熒光峰C、D的熒光強(qiáng)度反而有所增強(qiáng)，且出現(xiàn)新的熒光峰E類富里酸，說明兩種藻最外層黏液層SL-EPS中的類腐殖酸基團(tuán)及緊密型TB-EPS存在一定的差異性。其他淬滅現(xiàn)象與FACHB-905類似。

圖2 298 K下銅綠微囊藻905和469分層EPS加入Cd（Ⅱ）前后的三維熒光圖

淬滅過程可以分為動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅。動態(tài)淬滅指淬滅物質(zhì)與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子發(fā)生碰撞使其熒光減弱，淬滅常數(shù)隨溫度的升高而增大；而靜態(tài)淬滅則認(rèn)為是熒光物質(zhì)和淬滅物質(zhì)形成在該波長處不發(fā)熒光的絡(luò)合物，淬滅常數(shù)隨溫度的升高而減小。用Stern-Volmer方程對熒光淬滅的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合的結(jié)果如表1所示。

由表1可見，對 FACHB-469 的 SL-EPS 而言，熒光峰 B、C 在低溫下擬合 Stern-Volmer 方程線性較差（R2＜0.5），說明其不是單一淬滅，可能靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅同時發(fā)生，也可能存在包含一個明顯結(jié)合位點(diǎn)的非線性結(jié)合等溫線，并且游離淬滅劑濃度降低[11]。LB/TB-EPS 熒光峰B 的淬滅常數(shù)隨溫度的升高而增大，擬合線性較好，表明Cd（Ⅱ）對FACHB-905和FACHB-469的LB/TB-EPS熒光峰B符合動態(tài)淬滅。

圖3 不同溫度下銅綠微囊藻905和469分層EPS加入Cd（Ⅱ）后的熒光強(qiáng)度淬滅圖

表1 不同溫度下FACHB-905/469分層EPS與Cd（Ⅱ）的淬滅常數(shù)

而FACHB-905的SL-EPS中熒光峰B、C的淬滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，且其淬滅常數(shù)Kq大于動態(tài)淬滅中淬滅劑與生物大分子的最大淬滅分散碰撞常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，說明Cd（Ⅱ）對FACHB-905中SL-EPS熒光峰B、C以靜態(tài)淬滅過程為主導(dǎo)。為進(jìn)一步分析兩種藻分層EPS與Cd（Ⅱ）的淬滅機(jī)制，用修正后的Stern-Volmer 方程進(jìn)行擬合，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度下FACHB-905/469分層EPS與Cd（Ⅱ）的絡(luò)合參數(shù)

表2數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ACHB-905的擬合程度較差，而FACHB-469則較好，可見Cd（Ⅱ）更容易與FACHB-469形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。FACHB-469的LB-EPS中峰A、峰B穩(wěn)定常數(shù)logKa的平均值均大于TB-EPS，且峰A的logKa較大，說明Cd（Ⅱ）在LB-EPS形成的絡(luò)合物更穩(wěn)定，尤以色氨酸與Cd（Ⅱ）形成的絡(luò)合物穩(wěn)定；而芳香蛋白Ⅰ（峰B）被Cd（Ⅱ）絡(luò)合的熒光基團(tuán)的比例較大，說明相比峰A，峰B有更多的熒光基團(tuán)能被Cd（Ⅱ）絡(luò)合。

用修正后的Hill方程擬合結(jié)果見表3。由表3 可知，各層EPS 熒光峰A 與Cd（Ⅱ）的結(jié)合常數(shù)n＜1，說明色氨酸物質(zhì)基本不與Cd（Ⅱ）發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。SL-EPS 中峰C 的結(jié)合常數(shù)logKb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n遠(yuǎn)大于峰B，說明峰C 代表的類腐殖酸物質(zhì)比峰B 代表的類腐殖酸對Cd（Ⅱ）有更大的親和力。比較LB/TB-EPS 中峰 B 的結(jié)合常數(shù) logKb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（n＞1）可以發(fā)現(xiàn)：LB-EPS 的大于 TB-EPS 的，對于FACHB-905/406，其SL-EPS峰C與Cd（Ⅱ）的較大結(jié)合能力分別出現(xiàn)在低溫（288K）和高溫（308K），說明Cd（Ⅱ）更容易與兩種藍(lán)藻在LB-EPS 發(fā)生結(jié)合作用。對于FACHB-905，其LB/TB-EPS峰B結(jié)合反應(yīng)受溫度影響不大（n均大于1）。對于FACHB-406，其LB/TB-EPS峰B在低溫（288 K）下與Cd（Ⅱ）的結(jié)合能力更強(qiáng)，且隨溫度升高其結(jié)合常數(shù)logKb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均有所下降，說明溫度升高導(dǎo)致LB/TB-EPS峰B的有些結(jié)合位點(diǎn)失活，從而降低了對Cd（Ⅱ）的結(jié)合能力。比較最佳溫度下FACHB-905/406分層EPS的結(jié)合常數(shù)logKb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可以發(fā)現(xiàn)，從大到小依次為芳香蛋白Ⅰ、類腐殖酸和色氨酸，且后者對Cd（Ⅱ）的結(jié)合能力大于前者，這與上述結(jié)論一致。另外，n＞1說明相應(yīng)溫度下SL-EPS峰C及LB/TB-EPS峰B與Cd（Ⅱ）可能生成不止一種絡(luò)合物。為進(jìn)一步分析EPS與Cd（Ⅱ）的反應(yīng)機(jī)理，對其熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了計算，結(jié)果如表4所示。

表3 不同溫度下FACHB-905/469分層EPS與Cd（Ⅱ）的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

表4 不同溫度下FACHB-905/469分層EPS與Cd（Ⅱ）的熱力學(xué)參數(shù)

表4 中焓變（ΔH）和熵變（ΔS）用Van' t Hoff 方程計算：lnKb=-ΔH/RT+ ΔS/R，式中R指氣體常數(shù)8.314 J-1·mol-1，T是絕對溫度（K），Kb為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)。吉布斯自由能方程：ΔG=ΔH-TΔS。葉榮民[16]報道根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷小分子與蛋白質(zhì)間的主要作用力類型：ΔH＞0，ΔS＞0為典型的疏水作用力；ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵作用力或范德華力；ΔH≈0，ΔS＞0 為靜電作用力。由表4計算的數(shù)據(jù)可知，ΔG＜0，表示FACHB-905/469與Cd（Ⅱ）的絡(luò)合反應(yīng)都是自發(fā)進(jìn)行的。ΔS＜0，表示FACHB-905/469與Cd（Ⅱ）的絡(luò)合反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)。|T·ΔS|＞|ΔH|，表明反應(yīng)主要為熵驅(qū)動。ΔH＜0，ΔS＜0，這表明在這兩種銅綠微囊藻與Cd（Ⅱ）的反應(yīng)中氫鍵和范德華力起主要作用。

3 結(jié) 論

綜上所述，（1）FACHB-905共含有4種熒光基團(tuán)（色氨酸、芳香蛋白Ⅰ和2個類腐殖酸），F(xiàn)ACHB-469共含有6種熒光基團(tuán)（色氨酸、芳香蛋白Ⅰ和4種類腐殖酸）。兩者在SL-EPS中都含有3個熒光峰，峰A為色氨酸，峰B和C為類腐殖酸。在兩者的LB-EPS和FACHB-905的TB-EPS中，都含有2個熒光峰，峰A為色氨酸，峰B為芳香類蛋白Ⅰ。在FACHB-905的TB-EPS中除此外還含有2個類腐殖酸熒光峰。兩者在蛋白質(zhì)和多糖的分布上也存在差異。（2）FACHB-905和FACHB-469的LB/TB-EPS中芳香蛋白Ⅰ能被Cd（Ⅱ）有效淬滅，且以動態(tài)淬滅為主導(dǎo)，而對SL-EPS 中類腐殖酸的淬滅為靜態(tài)淬滅。加入Cd（Ⅱ）后FACHB-469 TB-EPS中出現(xiàn)了產(chǎn)生熒光的類富里酸物質(zhì)。（3）兩種藍(lán)藻分層EPS中芳香類蛋白比色氨酸、類腐殖酸有更大的Cd（Ⅱ）結(jié)合能力，且結(jié)合反應(yīng)主要發(fā)生在LB-EPS中。FACHB-469比FACHB-905更容易與Cd（Ⅱ）發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。（4）兩種藍(lán)藻與Cd（Ⅱ）的反應(yīng)都是自發(fā)的放熱反應(yīng)，氫鍵和范德華力在反應(yīng)中起主要作用。