納豆激酶溶栓功效與酶活測(cè)定研究進(jìn)展

李五林

【摘 ?要】納豆是日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品，納豆含有多種活性成分，其中納豆激酶對(duì)于血栓的去除有極強(qiáng)的功效，但納豆在中國(guó)的的推廣進(jìn)展緩慢，民眾對(duì)于納豆的結(jié)構(gòu)、功效、酶活的判定等不夠了解。本文概述了納豆激酶的結(jié)構(gòu)特性，納豆激酶的溶栓機(jī)理、抗血栓實(shí)驗(yàn)效果與酶活力的測(cè)定方法，并對(duì)納豆激酶的研究做出展望，以期增進(jìn)公眾對(duì)納豆激酶的認(rèn)知，并為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】納豆激酶;結(jié)構(gòu);抗血栓效果;酶活性測(cè)定方法

1 引言

血栓類疾病對(duì)患者的個(gè)人生活影響極大，如中風(fēng)患者常常突然昏倒、言語障礙或失語、偏身麻木甚至半身不遂，心肌梗塞容易造成心臟驟停、心源性休克甚至心臟破裂。根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO統(tǒng)計(jì)，截止2018年，我國(guó)以血栓為主要誘因的心血管病患者數(shù)量達(dá)2.9億，其發(fā)病死亡總數(shù)占居民總死亡數(shù)的40%，而在全球，直接或間接由血栓栓塞類疾病造成的死亡人數(shù)已達(dá)總死亡人數(shù)的51%，遠(yuǎn)高于癌癥等其他疾病。因此抗血栓成為了公眾和科學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)問題，而直接具有溶栓作用的相關(guān)生物酶的研究也成為了領(lǐng)域熱點(diǎn)。目前已開發(fā)應(yīng)用的生物溶栓酶有鏈激酶和尿激酶兩種，但其皆存在不可避免的缺陷。鏈激酶易激活全身纖溶系統(tǒng)，造成人體纖維蛋白原含量大幅下降和全身出血，同時(shí)鏈激酶存在抗原性，部分病人會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)。尿激酶是我國(guó)最主要的抗血栓藥物，但其對(duì)血栓骨架纖維蛋白特異性較低，不專門溶解血栓纖維蛋白，存在出血傾向，同時(shí)給藥劑量難以控制，另外尿激酶價(jià)格昂貴，而血栓患者往往需要長(zhǎng)期服藥，絕大部分患者根本無法承受。1987年，日本須見洋行博士靈光一現(xiàn)，想到其本土食品納豆的發(fā)酵過程中降解的主要物質(zhì)為纖維蛋白，而這正是血栓的核心骨架成分。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，他果然發(fā)現(xiàn)了一種有極大溶栓活性的物質(zhì)，其活性相當(dāng)于尿激酶的四倍之多，須見洋行將其命名為納豆激酶。此后，一系列關(guān)于納豆激酶更深入的研究得以展開，結(jié)果表明，納豆激酶的溶栓活性大大高于已有生物酶，同時(shí)其具有溶栓特異性，專一降解血栓骨架中的纖維蛋白，引起出血風(fēng)險(xiǎn)極低。同時(shí)其價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、對(duì)人體安全性高，有望替代已有生物酶，從而受到更廣泛關(guān)注，日本更是倡議國(guó)民從小學(xué)起便開始堅(jiān)持食用納豆。本文從活體抗血栓實(shí)驗(yàn)、結(jié)構(gòu)與生化特性、溶栓機(jī)理和活力測(cè)定方法幾個(gè)方面對(duì)納豆激酶的相關(guān)研究進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，并對(duì)一些問題進(jìn)行分析，以期更全面的了解納豆激酶，為后續(xù)進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

2納豆激酶的結(jié)構(gòu)與生化特性

2.1 納豆激酶的結(jié)構(gòu)

納豆激酶（Nattokinase簡(jiǎn)稱NK）又名枯草桿菌蛋白酶NAT，屬堿性絲氨酸蛋白酶，由枯草桿菌所屬的納豆菌代謝時(shí)所分泌，在細(xì)胞外進(jìn)行降解作用。酶分子為單鏈多肽，無二硫鍵，共含275個(gè)氨基酸，分子量為27.7 kDa。其與底物結(jié)合的中心由三個(gè)氨基酸（Ser125、Leu126、Gly127）構(gòu)成，催化活性中心為（Asp32、His64、Ser221）。其與枯草桿菌蛋白酶E在氨基酸序列的同源性達(dá)99.5%，僅僅在85和192位的氨基酸殘基存在差異，與枯草桿菌蛋白酶BPN的同源性達(dá)86%，但除NK外其他枯草桿菌蛋白酶均未發(fā)現(xiàn)纖溶活性，分析原因可能與蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。2010年，NK的X-射線晶體結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)，如圖1。由晶體結(jié)構(gòu)分析得出，NK中存在7個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)和9個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)，它們相互交錯(cuò)，呈現(xiàn)出NK整體的球狀結(jié)構(gòu)，其活性位點(diǎn)位即于球狀蛋白表面的溝槽內(nèi)。另外，

NK結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，與蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。在NK肽鏈中還存在發(fā)光氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，能為蛋白質(zhì)的光譜研究提供基礎(chǔ)。

2.2 納豆激酶的生化特性

NK適宜pH為5-12，最佳pH為7-9，適宜溫度為60 oC以下，最佳溫度為35-45 oC，而人體血液pH 約為7.35-7.45，血液溫度近似37.5-38 oC，這與NK的最佳環(huán)境極其一致，十分有利于NK表現(xiàn)最佳活性。但酸性環(huán)境和高溫都會(huì)讓NK迅速失活，因此一般納豆激酶產(chǎn)品利用腸衣包裹，避免其受到胃酸破壞，另外，有研究表明，單純食用納豆時(shí)，其中的納豆激酶在納豆粘液、食物中的蛋白質(zhì)、油脂等物質(zhì)的包裹下，能在酸性環(huán)境中仍保持部分活性。低溫對(duì)NK的影響不大，在-20 oC的環(huán)境下，反復(fù)凍融NK五次，其仍存留95%以上的活性。因此低溫冷藏可以作為納豆的有效儲(chǔ)存方式。經(jīng)Svunsson柱型電泳法，等電聚焦測(cè)定出NK的等電點(diǎn)為8.6±0.3，為NK的分離純化奠定了基礎(chǔ)。金屬離子對(duì)NK活性有一定影響，Na+、K+、Mg2+、Co2+、Ca2+、Tb3+等能提高其活性，Cu2+、Hg2+、Zn2+、Fe3+、Al3+則會(huì)不同程度的抑制其活性。這可能與金屬離子影響了NK的聚集性質(zhì)有關(guān)。

3 納豆激酶的溶栓機(jī)理

正常人體存在對(duì)立調(diào)控的凝血溶血系統(tǒng)，凝血系統(tǒng)保證血管壁破裂時(shí)及時(shí)填堵，溶血系統(tǒng)則保證血液暢通。當(dāng)凝血系統(tǒng)過強(qiáng)或溶血系統(tǒng)過弱時(shí)，便會(huì)形成血栓。當(dāng)人體血因外部物理因素等造成血管內(nèi)皮損傷后，體內(nèi)凝血系統(tǒng)激活，激活各種凝血因子，使血小板大量聚集，同時(shí)促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，并形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)作為血栓骨架，與聚集的血小板一起最終構(gòu)成血栓。人體內(nèi)部的纖溶酶是唯一能降解纖維蛋白從而促進(jìn)血栓溶解的物質(zhì)，大多數(shù)溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶等皆通過促進(jìn)纖溶酶的形成發(fā)揮溶栓作用。而納豆激酶除激活纖溶酶發(fā)揮作用外，還能直接作用與交聯(lián)纖維蛋白，發(fā)揮溶栓作用。NK作用機(jī)制見圖2，主要有四種途徑：a，直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)纖溶酶前體的調(diào)控因子的釋放，間接促進(jìn)纖溶;b，抑制a途徑中調(diào)控因子的抑制因子，避免纖溶受到阻礙;c，刺激尿激酶前體轉(zhuǎn)化為尿激酶，再由尿激酶激活纖溶酶前體轉(zhuǎn)化為纖溶酶，以此促進(jìn)纖溶;d，直接作用于纖維蛋白，降解血栓骨架，完成纖溶，這也是NK最主要的作用途徑。

4 活體抗血栓實(shí)驗(yàn)效果

4.1 直接抗血栓實(shí)驗(yàn)

研究者通過大鼠靜脈直接注射納豆激酶，發(fā)現(xiàn)NK具有明顯溶栓效果，且溶栓活性為血纖維蛋白溶酶的4倍以上。在小鼠頸部動(dòng)脈注射醋酸生成血栓的實(shí)驗(yàn)中，分別靜脈注射等摩爾數(shù)的納豆激酶、纖溶酶及彈性蛋白酶，1h測(cè)定的小鼠血流再通率分別為（62.0±5.3）%、（15.8±4.5）%及0%，NK的血流再通率大大高于纖溶酶和蛋形蛋白酶，且絕大部分實(shí)驗(yàn)組實(shí)現(xiàn)血流再通，體現(xiàn)了NK極高的體內(nèi)溶栓活性。

另外，在突發(fā)性血栓實(shí)驗(yàn)中，NK表現(xiàn)出了極佳的預(yù)防功效。研究者通過腸衣包裹納豆激酶口服給藥，確保其直達(dá)腸道吸收，持續(xù)進(jìn)藥15000IU/Kg/d，7天后通過FeCl3誘導(dǎo)模仿突發(fā)性血栓，比較實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水給藥的對(duì)照組的血栓重量（2.8mg）發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的突發(fā)性血栓重量（1.4mg）大幅度降低，表明NK能有效抵抗和減緩?fù)话l(fā)性血栓的形成。

4.2 間接抗血栓實(shí)驗(yàn)

在研究小鼠對(duì)納豆激酶的腸道吸收實(shí)驗(yàn)中，通過小鼠十二指腸給藥，在3-5h后即在血液中檢測(cè)到納豆激酶，表明NK可經(jīng)腸道吸收。研究者以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究NK的體內(nèi)溶栓作用底物，發(fā)現(xiàn)納豆激酶發(fā)揮作用時(shí)直接降解血栓骨架-交聯(lián)纖維蛋白，但對(duì)纖維蛋白前置物纖維蛋白原不敏感，這種直接作用十分有利于NK發(fā)揮其溶栓效果，且不易引起出血傾向。以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究NK的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用實(shí)驗(yàn)中，在大鼠血管內(nèi)皮損傷的前三周到后三周持續(xù)給與與含NK的納豆提取物，比較血管損傷開始和三周后的血管內(nèi)膜/中層厚度值，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組（0.06±0.01）較對(duì)照組（0.15±0.03）數(shù)值明顯減?。≒<0.05），且尤球蛋白凝塊溶解時(shí)間縮短，這表明NK能有效抑制大鼠血管壁血栓的形成。

另有研究者利用血液中的血栓骨架-纖維蛋白的降解產(chǎn)物D-dimmei和FDP的含量表征納豆激酶的抗血栓效果，通過注射角叉菜膠在小鼠體內(nèi)形成血栓，再將納豆激酶分低、中、高劑量組連續(xù)灌胃一周，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組，結(jié)束后取腔靜脈血分析血液中FDP、D-dimmer濃度。結(jié)果顯示，低劑量組FDP、D-dimmer含量與對(duì)照組相近，未表現(xiàn)明顯差異，而中劑量、高劑量組FDP、D-dimmer含量分別為對(duì)照組的2倍和3倍多，差異明顯。這表明中高劑量的納豆激酶降解了血栓，有很好的抗血栓療效，且其抗血栓作用表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

4.3人體臨床效果

通過對(duì)心血疾病患者的研究發(fā)現(xiàn)，納豆激酶能夠降低患者出現(xiàn)心肌缺血的概率，減小心機(jī)梗死的面積。在一項(xiàng)志愿者參與的實(shí)驗(yàn)中，研究者利用腸溶膠囊給藥避免NK受到胃酸腐蝕，對(duì)照組服用煮熟大豆，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間（ELT）、溶解活性（EFA）和纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP），結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組志愿者血液中ELT明顯縮短，EFA大大提高，同時(shí)FDP顯著增加增加，這表明NK促進(jìn)了人體中血栓的降解，顯現(xiàn)出較強(qiáng)的抗血栓活性。2015年，國(guó)家藥品批準(zhǔn)納豆激酶作為一種功效成分上市，納豆激酶得到官方認(rèn)可，繼而市場(chǎng)上出現(xiàn)大量納豆激酶產(chǎn)品，其中以膠囊、軟膠囊、微囊等最為多見。其利用腸溶外衣結(jié)構(gòu)，避免納豆激酶受到胃部極酸環(huán)境（pH約 0.9-1.8）的破壞，從而保證NK有效的腸道吸收。

5 納豆激酶活力的測(cè)定方法

納豆激酶活力測(cè)定主要基于其三種特性，纖溶特性、降解特定枯草桿菌底物特性和抗原特性。相應(yīng)其活力測(cè)定主要有三類方法：a，通過溶解模擬血栓的纖維板從而形成溶圈，比較樣品溶圈面積和標(biāo)準(zhǔn)酶溶圈面積，根據(jù)面積與活力關(guān)系得到樣品酶活的纖維板法及其改進(jìn)的各種方法;b，通過直接降解幾種特定底物，根據(jù)生成產(chǎn)物的速率定義得出酶活，產(chǎn)物定量方式有表觀明顯現(xiàn)象如氣泡、通過產(chǎn)物測(cè)定吸光度或經(jīng)顯色反應(yīng)后測(cè)定吸光度等;c，根據(jù)NK的抗原特性用特異性抗體捕獲，與另一抗體二次結(jié)合后以過氧化物酶與二次抗體的反應(yīng)確定一次結(jié)合的抗體量，進(jìn)而確定NK的活力的酶聯(lián)免疫吸附法。

5.1 纖維板法及其改進(jìn)

作為NK發(fā)現(xiàn)者驗(yàn)證其纖溶活性的經(jīng)典方式，纖維板法及其改進(jìn)的各種活力測(cè)定方法能直接反應(yīng)NK的纖溶活性，且其操作簡(jiǎn)單易行，并可以同時(shí)測(cè)定多種樣品，因此是目前最為常用的NK活力檢測(cè)方法。該方法利用凝血酶與牛纖維蛋白原反應(yīng)，在平板中生成纖維蛋白，打孔后將一定體積適宜酶活的樣品酶注入孔內(nèi)，37 oC恒溫孵育18h測(cè)定溶圈面積，再將溶圈面積帶入面積-酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算樣品酶活。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法為：配置不同濃度的尿激酶，再分別于纖維平板中恒溫孵育出對(duì)應(yīng)的不同溶圈面積，面積與酶活成線性關(guān)系，從而得到溶圈面積-酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。此法也存在許多缺陷，由于溶圈面積是表觀值，而一般形狀又不完全規(guī)則，因此受個(gè)人測(cè)量誤差影響較大，而溶圈面積受孵育條件與酶純度干擾，孵育時(shí)間、溫度、孵育平板、酶雜質(zhì)都會(huì)對(duì)溶圈面積造成影響。另外，纖維平板所用纖維蛋白原價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本較高。這些因素導(dǎo)致纖維板法數(shù)據(jù)波動(dòng)性大，且具有一定人為主觀性，難以多次重復(fù)等問題。

纖維板法的改進(jìn)主要有：a，增加瓊脂糖基底的瓊脂糖-纖維板法;b，增加聚丙烯酰胺基底并用特定模具代替玻璃或塑料皿，輔以指示劑放大蛋白降解效果的聚丙烯酰胺纖維蛋白膠板法;c，直接測(cè)定纖維蛋白形成初始加入NK前后，吸光度變化的血清板法。增加瓊脂糖基底能有效避免塑料平皿底部差異和不平現(xiàn)象，且有效減少纖維蛋白用量，聚丙烯酰胺和特定模具則進(jìn)一步提高了制板精度，能一定程度提高數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。血清板法在血清板小孔中形成微型血栓，在加入NK反應(yīng)前后測(cè)定OD655，操作更加簡(jiǎn)便快捷，但一般紫外分光光度計(jì)無法直接測(cè)定血清板樣品，設(shè)備要求較高。

5.2通過降解特定底物確定酶活的方法

NK作為一種纖維蛋白降解酶，可以作用于纖維蛋白，同時(shí)NK屬枯草芽孢桿菌，能降解部分適應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶的底物，如四肽底物、甲基苯磺酸-L-精氨酸甲酯（TEAM）、酪蛋白等，根據(jù)底物命名的方法對(duì)應(yīng)為纖維塊溶解時(shí)間法（CLT）、四肽底物法、TEAM法和酪蛋白法。

以纖維蛋白為底物的CLT法能粗略測(cè)定NK酶活，是纖溶酶、尿激酶等抗血栓酶常用的酶活測(cè)定方法。在37 oC恒溫水浴環(huán)境下，利用凝血酶與一定量纖維蛋白原生成纖維蛋白，從加入酶后體系產(chǎn)生氣泡起，到無氣泡冒出作為樣品反應(yīng)時(shí)間。先測(cè)定已知活力的不同尿激酶對(duì)應(yīng)的溶解時(shí)間，得到酶活-溶解時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)定酶樣品的溶解時(shí)間，帶入標(biāo)曲中得出酶活。此法方便快捷，但是精度較低，同時(shí)無法同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品。

四肽底物法源于與NK同源性達(dá)99.5%的枯草桿菌蛋白酶E的活力測(cè)定方法，NK能將人工合成的小分子四肽Suc—Ala—Ala—Pro—Phe—pNA水解生成顯色物質(zhì)對(duì)硝基苯胺（p-NA），在410nm出測(cè)定吸光度，根據(jù)p-NA生成的量得出NK活力。該方法簡(jiǎn)便迅捷，精度較高，但不能完全反映纖溶活性。

TEAM可被NK切割生成甲醇，甲醇被高錳酸鉀氧化為甲醛，后能與變色酸在沸水中發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)物在574nm處有強(qiáng)吸收，根據(jù)吸光度和反應(yīng)關(guān)系從而得出NK樣品酶活。此法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，但易受樣品中雜質(zhì)的影響，另外其酶活結(jié)果不能完全代表纖溶活性。

酪蛋白法來源于經(jīng)典的枯草桿菌蛋白酶活力測(cè)定方法，NK與酪蛋白40 oC水浴生成酪氨酸，酪氨酸與福林酚試劑30 oC下能發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)物在680nm處有強(qiáng)烈吸收，以已知不同濃度的酪氨酸與福林酚反應(yīng)，得到濃度吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由酶活定義得出酶活-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，由最終吸光度即可得出NK樣品酶活。該法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品等，同時(shí)有研究表明此法得出的酶活結(jié)果與纖溶活性呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，故此法有望成為新的NK活力檢測(cè)方法。但由于NK特殊性，此法實(shí)際應(yīng)用于NK時(shí)也存在一些問題，如酶樣品中雜質(zhì)的影響等。

5.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

根據(jù)NK的抗原性分別制備其單克隆和多克隆抗體，先將NK與單克隆抗體結(jié)合，將多克隆抗體與過氧化物連接，再將NK結(jié)合體與多克隆復(fù)合體結(jié)合形成類似三明治的結(jié)構(gòu)，過氧化物酶能與底物發(fā)生反應(yīng)，生成顯色產(chǎn)物，在490nm出有強(qiáng)吸收，有吸光度即可確定NK樣品的活性。此法靈敏度極高，但操作極為繁瑣，價(jià)格昂貴，自報(bào)道以來未見后續(xù)研究。

6 結(jié)論與展望

到目前為止，納豆激酶的抗血栓效果已經(jīng)得到了初步的驗(yàn)證，在小鼠、犬、兔等模型中觀察到了明顯的溶栓效果，在人體臨床實(shí)驗(yàn)中也得到了積極的從側(cè)面反映的抗血栓療效，但缺乏更直觀的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒于血栓疾病的長(zhǎng)期性，外界環(huán)境因素的復(fù)雜性，這可能是極具挑戰(zhàn)性的問題。NK結(jié)構(gòu)特征和作用機(jī)理已經(jīng)基本明晰，基因工程研究正嘗試使NK在植物或者其他機(jī)體中直接表達(dá)出來，同時(shí)優(yōu)化改進(jìn)其基因以期得到更強(qiáng)更適應(yīng)于人體的抗血栓產(chǎn)品。NK具體活力的測(cè)定已經(jīng)有較多依據(jù)，市面上的相關(guān)產(chǎn)品也十分豐富，NK正越來越為人們熟知，有望為更多血栓疾病患者帶來希望。

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