人參皂苷Rb3聯(lián)合β-細(xì)辛醚對(duì)血管性癡呆模型小鼠的改善作用及其機(jī)制研究

鄧敏貞 鐘曉琴 高志杰 孫一凡 黃麗平

摘 要 目的：研究人參皂苷Rb3聯(lián)合β-細(xì)辛醚對(duì)血管性癡呆（VD）模型小鼠的改善作用及其機(jī)制。方法：將ICR小鼠隨機(jī)分為模型組、人參皂苷Rb3組（10 mg/kg）、β-細(xì)辛醚組（10 mg/kg）、聯(lián)合用藥組（人參皂苷Rb3 10 mg/kg +β-細(xì)辛醚10 mg/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組（鹽酸多奈哌齊1 mg/kg）和蛋白激酶B（Akt）抑制劑組（LY294002，1 mg/kg），并設(shè)假手術(shù)組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組小鼠均按四血管阻斷法復(fù)制VD模型。造模后，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，Akt抑制劑組腹腔注射相應(yīng)藥物，其余各組均灌胃相應(yīng)藥物，每日2次，連續(xù)30 d。末次給藥后，采用避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)其海馬組織中4-羥基壬烯酸（4-HNE）、 8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）、活性氧（ROS）含量，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)海馬組織中B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax） mRNA的表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)皮質(zhì)中Bcl-2蛋白的表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的避暗潛伏期均顯著延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)均顯著減少，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且聯(lián)合用藥組的效果最為顯著（P<0.05或P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：人參皂苷Rb3聯(lián)合β-細(xì)辛醚對(duì)VD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有一定改善作用，且效果優(yōu)于各化合物單用。這種作用可能與抗氧化應(yīng)激、抗海馬組織凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 人參皂苷Rb3;β-細(xì)辛醚;血管性癡呆;氧化應(yīng)激;凋亡;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of ginsenoside Rb3 combined with β-asarone on vascular dementia （VD） model mice and its mechanism. METHODS： ICR mice were randomly divided into model group， ginsenoside Rb3 group （10 mg/kg）， β-asarone group （10 mg/kg）， drug combination group （ginsenoside Rb3 10 mg/kg+β-asarone 10 mg/kg）， positive control group （donepezil hydrochloride 1 mg/kg） and Akt inhibitor group （LY294002， 1 mg/kg）， and sham operation group was set up， with 10 mice in each group. Except for sham operation group， VD model was induced by four vessel occlusion method in other groups. After modeling， sham operation group and model group were given constant volume of normal saline， Akt inhibitor group was given relevant medicine intraperitoneally， and other groups were given relevant medicine intragastrically， twice a day， for consecutive 30 d. After last administration， the learning and memory ability of mice was detected by avoiding darkness test. The contents of 4-hydroxydecenoic acid （4-HNE）， 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） and reactive oxygen species （ROS） in hippocampus was detected by ELISA. RT-PCR assay was used to detect the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus. The protein expression of Bcl-2 in cortex was detected by immunofluorescence method. Western blotting assay was used to detect the protein expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus. RESULTS： Compared with sham operation group， the incubation period of avoiding darkness test in model group was shortened significantly; and the number of errors was increased significantly; 4-HNE， 8-OHdG and ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were increased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the incubation period of avoiding darkness test was prolonged significantly in ginsenoside Rb3 group， β-asarone group， drug combination group and positive control group， the number of errors was decreased significantly; 4-HNE， 8-OHdG， ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were decreased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 were increased significantly， especially in drug combination group （P<0.05 or P<0.01）. But the incubation period of avoiding darkness test was shortened significantly in Akt inhibitor group， and the number of errors was increased significantly; 4-HNE， 8-OHdG， ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were increased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Ginsenoside Rb3 combined with β-asarone has a protective effect on VD model mice， and the effect was better than that of each compound alone. The mechanism of which may be associated with anti-oxidative stress and anti-apoptosis of hippocampus.

KEYWORDS? ?Ginsenoside Rb3; β-asarone; Vascular dementia; Oxidative stress; Apoptosis; Mice

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是一種由缺血性腦血管疾病所致腦組織局部腦血流量減少、缺氧等因素所造成的中樞神經(jīng)功能障礙性疾病，主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙[1]。研究發(fā)現(xiàn)，VD和散發(fā)性阿爾茨海默病的共同始動(dòng)環(huán)節(jié)是慢性腦組織血液供應(yīng)不足[2]。目前，臨床尚無(wú)理想的防治認(rèn)知功能障礙的藥物。中藥復(fù)方由于具有多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，對(duì)癡呆疾病的預(yù)防和治療具有一定的優(yōu)勢(shì)[3]，故有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

人參發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是人參總皂苷，其中人參皂苷Rb類(lèi)成分的含量較高。有研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷具有提高學(xué)習(xí)記憶的能力[4]。石菖蒲臨床廣泛用于中風(fēng)后遺癥、健忘等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[5]。β-細(xì)辛醚作為石菖蒲揮發(fā)油的主要活性成分，具有保護(hù)心血管、易透過(guò)血腦屏障等特點(diǎn)，在心腦血管疾病的防治中具有重要價(jià)值[6]。人參和石草蒲都是益智古方定志小丸的主要成分[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷聯(lián)合石菖蒲揮發(fā)油可有效改善癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[8];此外有研究證實(shí)，β-細(xì)辛醚可減緩癡呆模型小鼠的認(rèn)知功能障礙[9-10]，人參皂苷Rb3對(duì)心臟血管再灌注和大腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用[11-12]。在上述研究的基礎(chǔ)上，本文主要探索人參皂苷Rb3與β-細(xì)辛醚聯(lián)用對(duì)VD模型小鼠的改善作用，并初步研究其作用機(jī)制，以期為治療VD的新藥開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SBA-2 型小鼠避暗儀（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）;IKA T10基礎(chǔ)型分散機(jī)（德國(guó)IKA公司）;5804R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;ME403型電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];Biotek-EON型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）;CFX96型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Bio Rad公司）;TI2-E型全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb3對(duì)照品、β-細(xì)辛醚對(duì)照品（四川維克奇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：wkq18020701、wkq18042602，純度均大于98%）;鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1706077，規(guī)格：5 mg];LY294002[蛋白激酶B（Akt）抑制劑，美國(guó)Med Chem Express公司，批號(hào)：154447-36-6];水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170414）;4-羥基壬烯酸（4-HNE）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：UK92FFJBWN）;8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：C22013999）;活性氧（ROS）ELISA試劑盒（南京草本源生物科技有限公司，批號(hào)：07/2019）;Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：191012）;PrimeScriptTM RT Reagent Kit、SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ[寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)：RR037A、RR820A];B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成;4%多聚甲醛（廣州晶欣生物科技有限公司，批號(hào)：JX0100）;兔源Bcl-2克隆抗體（批號(hào)：ab182858和#3498S）、兔源Bax抗體（批號(hào)：#2772S）多克隆、兔源GAPDH單克隆抗體（批號(hào)：5174S）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：7074S）均購(gòu)自美國(guó)CST公司;SABC-FITC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：SA1062）;生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1910242706）;蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0013B）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠70只，雄性，3月齡，體質(zhì)量（25±2）g，由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2014-0035。所有小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意。

2 方法

2.1 造模

參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]按四血管阻斷法復(fù)制VD模型。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）進(jìn)行麻醉，分離小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾阻斷其血流30 min，松開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)血流10 min，重復(fù)3次。于第1次阻斷血流5 min后，斷尾放血約0.3 mL。于第3次缺血再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其恢復(fù)正常后即可縫合皮膚。

2.2 分組與給藥

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置給藥劑量。將60只VD模型小鼠隨機(jī)分為模型組、人參皂苷Rb3組（10 mg/kg）、β-細(xì)辛醚組（10 mg/kg）、聯(lián)合用藥組（人參皂苷Rb3 10 mg/kg+β-細(xì)辛醚10 mg/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組（鹽酸多奈哌齊，1 mg/kg）和Akt抑制劑組（LY294002，1 mg/kg），并另設(shè)假手術(shù)組（按“2.1”項(xiàng)下方法操作，但不行缺血再灌注），每組 10 只。模型組和假手術(shù)組小鼠灌胃等體積生理鹽水，Akt抑制劑組小鼠腹腔注射相應(yīng)藥物，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日2次，連續(xù)30 d。

2.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)價(jià)

采用避暗實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。第29天給藥結(jié)束后，將各組小鼠置于避暗儀中適應(yīng)2 min 后，將其背對(duì)暗室的洞口放入明室。小鼠進(jìn)入暗室，受到電擊后逃出暗室，如此訓(xùn)練5 min。24 h后（即末次給藥后）正式檢測(cè)，將每只小鼠分別置于明室，記錄其從明室第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間（避暗潛伏期）和5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）。

2.4 小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死各組小鼠，迅速取出其左側(cè)海馬組織，精密稱定質(zhì)量后以生理鹽水制成10%海馬組織勻漿，于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，吸取上清液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)情況檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)情況。取各組小鼠右側(cè)部分海馬組織，按照Trizol試劑盒操作提取總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM RT Reagent Kit說(shuō)明書(shū)操作逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，置PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共25 μL）：2×SYBR? Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40次循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法分析各組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)水平。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

2.6 小鼠皮質(zhì)中Bcl-2蛋白表達(dá)情況檢測(cè)

采用免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠皮質(zhì)中Bcl-2蛋白表達(dá)情況。各組隨機(jī)取3只小鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片、脫蠟至水后，于3%雙氧水中浸泡30 min，用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，恢復(fù)室溫后用組化筆劃圈，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）漂洗3次，每次5 min，隨后滴加正常山羊血清，室溫下孵育30 min，不漂洗直接滴加Bcl-2一抗（稀釋比例為1 ∶ 50），37 ℃孵育2 h;PBS漂洗3次，每次5 min;滴加生物素（稀釋比例為1 ∶ 100），室溫孵育30 min;滴加SABC-FITC（稀釋比例為1 ∶ 200），室溫避光孵育30 min;PBS漂洗3次，每次5 min。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫避光孵育5 min，PBS漂洗3次，每次5 min，最后用防熒光淬滅封片，在熒光顯微鏡下觀察Bcl-2熒光強(qiáng)度并以陽(yáng)性細(xì)胞百分比表示其蛋白表達(dá)水平。

2.7 小鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。各組隨機(jī)取3只小鼠右側(cè)海馬組織，稱定質(zhì)量，加入現(xiàn)配的含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上勻漿促其充分裂解，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取其上清液以BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取煮沸變性后的蛋白樣本40 μg，以10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，再以5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入Bcl-2、Bax、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBST溶液清洗;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗于室溫下孵育1 h，再用TBST溶液清洗。經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光液顯影和定影后采用Image J 8.0軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)標(biāo)（GAPDH）的灰度值比值表示該蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的避暗潛伏期均顯著延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多（P<0.05）。與人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、Akt抑制劑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠的避暗潛伏期顯著延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況見(jiàn)表2。

3.2 小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG和ROS含量

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著降低（P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、Akt抑制劑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bax mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、聯(lián)合用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高，Bax mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bax mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與人參皂苷Rb3組、β-細(xì)辛醚組、Akt抑制劑組比較，聯(lián)合用藥組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Bax mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

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（收稿日期：2020-03-26 修回日期：2020-07-02）

（編輯：鄒麗娟）