外周血Th1/Th2/Treg細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平在耐多藥結(jié)核疾病中的診斷價(jià)值及意義

如克亞木·阿不都沙拉木 古麗巴哈爾·阿不拉合買(mǎi)提 李樹(shù)濤 阿布都沙拉木·托合提

耐多藥肺結(jié)核是指感染結(jié)核分枝桿菌后對(duì)利福平耐藥、異煙肼耐藥的肺結(jié)核，其主要特點(diǎn)為高治療費(fèi)、低治愈率及高死亡率，是臨床結(jié)核病治療的難題之一[1-2]。據(jù)相關(guān)研究證實(shí)，其病因與臨床不合理用藥相關(guān)，因機(jī)體內(nèi)基因突變?cè)斐伤幬锝档蛯?duì)突變菌的作用，故耐藥菌株增多是誘發(fā)耐藥的重要原因[3-4]。結(jié)核分支桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫是機(jī)體內(nèi)主要的抗結(jié)核免疫，而機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子與細(xì)胞免疫強(qiáng)弱密切相關(guān)。因此結(jié)核病的研究重點(diǎn)是分析其細(xì)胞免疫。經(jīng)查閱發(fā)現(xiàn)Th1/Th2/Treg細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平在耐多藥結(jié)核患者中的研究甚少，因此本研究將探討外周血Th1/Th2/Treg細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平在耐多藥結(jié)核患者中的診斷價(jià)值及意義，以期為臨床提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、患者臨床資料

回顧性分析自2016年2月-2020年2月于我院接受治療的肺結(jié)核患者99例，分為無(wú)耐藥組和耐藥組，其中無(wú)耐藥組：肺結(jié)核患者共52例，男31例(占比59.62%)，女21例(占比40.38%)，年齡為20～54歲、平均年齡為(34.83±7.21)歲；耐藥組：肺結(jié)核患者47例，男27例(占比57.45%)，女20例(占比42.55%)，年齡為19～54歲、平均年齡為(34.62±7.35)歲；另外抽取同期體檢的健康者76例作為健康組：男45例(占比59.21%)，女31例(占比40.79%)，年齡為20～53歲、平均年齡為(34.48±7.19)歲。

三組患者一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。本研究方案的制定符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》的相關(guān)要求。

二、入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核根據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，耐多藥肺結(jié)核根據(jù)2019版《耐多藥肺結(jié)核診斷和治療指南》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)X線胸片或胸部CT診斷為肺結(jié)核；首次接受治療者；年齡>18歲；未合并其他傳染病病原合并感染者，如乙肝、艾滋病等。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并慢性阻塞性肺疾病、糖尿病或惡性腫瘤者；合并慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等其他慢性感染；近3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物；妊娠期或哺乳期婦女；免疫功能障礙者。

三 實(shí)驗(yàn)方法

1 主要儀器及試劑

DW-86L626超低溫冰箱(生產(chǎn)廠家：海爾特種電器有限公司)；L535R臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)(生產(chǎn)廠家：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL型流式細(xì)胞儀；DD-5M低速大容量離心機(jī)(生產(chǎn)廠家：湖南湘立科學(xué)有限公司)；南京卡米洛生物工程有限公司生產(chǎn)的本研究所需的試劑盒；上?；鄯f生物科技有限公司生產(chǎn)的PBS緩沖液；美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)的熒光抗體。

2 檢測(cè)外周血Th1/Th2/Treg細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平

所有患者入院后均抽取空腹8h以上肘靜脈血3～5mL，以3500 r/min離心15 min后提取血清50μ放入離心管，分離單個(gè)核細(xì)胞。采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司生產(chǎn))測(cè)定Th1/Th2/Treg細(xì)胞比例：將細(xì)胞分為三份，CD4-FITC+IFN-γ-APC抗體標(biāo)記Th1細(xì)胞，CD4-FITC+IL-4-cy5抗體標(biāo)記Th2細(xì)胞，CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3抗體標(biāo)記Treg細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，將100 μL以上熒光抗體加入對(duì)應(yīng)單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)，室內(nèi)避光孵育1 h，沖洗(PBS緩沖液)，將破膜劑加入，再次避光孵育15 min，PBS沖洗后上機(jī)收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

Th1細(xì)胞因子IFN-γ、Th2細(xì)胞因子IL-4及Treg細(xì)胞因子IL-10均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，其操作過(guò)程需嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3 數(shù)據(jù)分析

用Flow-Check標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正儀器光路，調(diào)整FITC/PE的熒光補(bǔ)償，以CD4/IFN-γ、CD4/IL-4和CD4/CD25/Foxp3分別建立雙參數(shù)直方圖，得出CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-4+和CD4+/CD25+/Foxp3+的比例。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組Th1細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較

與對(duì)照組相比，耐藥組和無(wú)耐藥組患者血清Th1細(xì)胞、IFN-γ水平均顯著降低(tTh1=27.652、25.508，PTh1均<0.001；tIFN-γ=31.709、29.309，PIFN-γ均<0.001)，且耐藥組患者血清Th1細(xì)胞、IFN-γ水平均顯著低于無(wú)耐藥組(tTh1=2.182，PTh1=0.031；tIFN-γ=2.781，PIFN-γ=0.006)(見(jiàn)表1)。

表1 三組Th1細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較

二、三組Th2細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較

與對(duì)照組相比，耐藥組和無(wú)耐藥組患者血清Th2細(xì)胞以及IL-4水平均顯著降低(tTh1=29.457、18.881、17.227，PTh1均<0.001；tIL-4=31.741、16.838、14.995，PIL-4均<0.001)，且耐藥組患者血清Th2細(xì)胞以及IL-4水平均顯著低于無(wú)耐藥組(tTh2=2.077，PTh2=0.041；tIL-4=2.333，PIL-4=0.022)(見(jiàn)表2)。

三、三組Treg細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較

與對(duì)照組相比，耐藥組和無(wú)耐藥組患者血清Treg細(xì)胞和IL-10水平均顯著降低(tTreg=28.560、14.002，PTreg均<0.001；tIL-10=27.853、21.376，PIL-10均<0.001)，且耐藥組患者血清Treg細(xì)胞和IL-10水平均顯著低于無(wú)耐藥組(tTreg=2.339，PTreg=0.022；tIL-10=3.395，PIL-10=0.001)(見(jiàn)表3)。

表2 三組Th2細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較

表3 三組Treg細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子水平比較

討 論

據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，我國(guó)耐多藥肺結(jié)核發(fā)病率據(jù)全球第2位，復(fù)治肺結(jié)核患者具有明顯的耐藥性，同時(shí)耐藥性也是結(jié)核病防治工作中急需解決的難點(diǎn)及重點(diǎn)問(wèn)題[5-6]。耐多藥肺結(jié)核誘因較多，患者免疫力降低是結(jié)核分枝桿菌感染的重要危險(xiǎn)因素，且可增加結(jié)核分枝桿菌耐藥性[7-8]。因此，通過(guò)分析耐多藥肺結(jié)核患者免疫水平的變化情況，從而進(jìn)一步探討其對(duì)患者病情影響的的價(jià)值及意義，對(duì)該疾病的臨床治療尤為重要。

Th1/Th2型細(xì)胞因子在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用，相關(guān)研究顯示，耐多藥結(jié)核的主要發(fā)病機(jī)制是患者外周血中Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞降低導(dǎo)致[9-10]。Th1細(xì)胞主要抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答，可分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，增加免疫應(yīng)答[11]。Th2細(xì)胞可分泌白細(xì)胞介素IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，對(duì)Th1細(xì)胞增殖具有抑制作用，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，耐藥組和無(wú)耐藥組患者血清Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IFN-γ水平、Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-4水平以及Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-10水平均顯著降低(P均<0.001)；耐藥組患者血清Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IFN-γ水平、Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-4水平以及Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子TGF-β水平均較不耐藥組患者顯著降低(P均<0.05)，表明：耐藥和無(wú)耐藥結(jié)核患者免疫細(xì)胞水平均低于健康對(duì)照人群，而耐多藥結(jié)核患者免疫細(xì)胞水平則較無(wú)耐藥組患者更低，以上研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。例如，劉鳳娟[13]等學(xué)者通過(guò)研究提示，肺結(jié)核患者體內(nèi)Th1細(xì)胞、IFN-γ水平及Th2細(xì)胞、IL-4水平明顯低于正常人；余美玲[14]等研究提示，Thl型細(xì)胞因子與Th2型細(xì)胞因子水平可隨肺結(jié)核患者病情變化增高或降低，病情越嚴(yán)重則其水平越低反之則相反。Miahipour[15]等研究提示，Th細(xì)胞亞群的失衡與耐多藥肺結(jié)核的發(fā)生密切相關(guān)，特別是Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子降低。

Treg細(xì)胞是一類(lèi)控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，對(duì)Th1等所介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫應(yīng)答具有仰止作用，當(dāng)機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子不平衡時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響抗結(jié)核免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受到抑制[16]。本研究結(jié)果提示，耐藥組與無(wú)耐藥組患者血清Treg細(xì)胞、IL-10水平明顯低于健康組，并且以耐藥組患者血清Treg細(xì)胞、IL-10水平最低(P>0.05)，提示結(jié)核病患者免疫功能明顯受到抑制，而耐多藥結(jié)核患者免疫抑制程度則比無(wú)耐藥患者更為嚴(yán)重，與前人研究結(jié)果相似，如王國(guó)戧[17]等學(xué)者通過(guò)研究提示，在結(jié)核性胸膜炎患者體內(nèi)Treg細(xì)胞水平明顯降低，且低于正常人水平。另外本研究時(shí)間有限所納入樣本量較少，且隨訪時(shí)間較短，故進(jìn)一步研究時(shí)，應(yīng)在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)對(duì)耐多藥結(jié)核患者免疫細(xì)胞中的Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子進(jìn)行分析，且增加隨訪時(shí)間，深入研究論證。

總之，結(jié)核患者外周血中Th1細(xì)胞、IFN-γ，Th2細(xì)胞、IL-4以及Treg細(xì)胞、IL-10水平則高于健康人，特別是耐多藥結(jié)核患者上述細(xì)胞因子變化更大，說(shuō)明耐多藥結(jié)核患者中免疫功能受損較為嚴(yán)重，Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子可能成為臨床治療耐多藥結(jié)核患者的新方向。