毛竹薄壁細(xì)胞組分分布及取向顯微成像研究

馮 龍， 孫存舉， 畢文思， 任珍珍， 劉杏娥， 江澤慧， 馬建鋒*

1. 國際竹藤中心竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100102 2. 四川省林業(yè)和草原調(diào)查規(guī)劃院， 四川 成都 610500 3. 國家林業(yè)和草原局管理干部學(xué)院， 北京 102600

引 言

拉曼光譜應(yīng)用于植物細(xì)胞壁主要組分結(jié)構(gòu)表征及分子取向的研究始于1986年， Atalla等用拉曼光譜闡明了針葉木管胞中纖維素及木質(zhì)素的分子取向與拉曼光譜特征峰強(qiáng)度間的相關(guān)性[1]。 隨著激光器及共聚焦成像技術(shù)的進(jìn)步， 直到2006年顯微拉曼光譜技術(shù)才成功應(yīng)用于針葉木管胞細(xì)胞壁主要組分分布的研究[2]， 隨后這一技術(shù)在桉樹[3]、 竹材[4]、 黃瓜[5]、 黃藤[6]等植物細(xì)胞壁研究中廣泛應(yīng)用。

竹材作為一種重要的天然梯度材料， 主要由維管束及圍繞維管束的基本薄壁組織構(gòu)成， 其中維管束是由高度木質(zhì)化的纖維細(xì)胞圍繞篩管和伴胞組成， 基本薄壁組織則由大量薄壁細(xì)胞排列構(gòu)成。 竹材因其優(yōu)良的抗拉強(qiáng)度、 抗拉模量、 抗壓強(qiáng)度、 抗壓模量等廣泛應(yīng)用于建筑、 工程材料等領(lǐng)域[7]， 而竹材優(yōu)良的力學(xué)特性取決于纖維和薄壁細(xì)胞的組織比量、 組分分布規(guī)律及微纖絲取向。 目前已開展的竹材分子光譜研究闡明了纖維細(xì)胞的組分分布規(guī)律及纖絲取向， 而薄壁細(xì)胞分子光譜成像的研究仍屬空白。 盡管偏光顯微鏡[8]、 透射電子顯微鏡[9]、 紫外顯微鏡[10]， 原子力顯微成像[11]等已經(jīng)應(yīng)用于薄壁細(xì)胞的研究， 但主要是針對細(xì)胞壁分層結(jié)構(gòu)及木質(zhì)素分布規(guī)律研究， 而對纖維素的分布和取向， 木質(zhì)素相聯(lián)接的結(jié)構(gòu)單元的研究鮮有報(bào)道。 故此利用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)在細(xì)胞乃至亞細(xì)胞尺度研究了毛竹(Phyllostachyspubescens)節(jié)間組織中薄壁細(xì)胞纖維素及木質(zhì)素相連接結(jié)構(gòu)單元的空間分布， 同時(shí)探索了纖維素分子的空間取向規(guī)律， 半定量的研究結(jié)果有助于加深對竹材薄壁細(xì)胞壁力學(xué)變異的理解， 同時(shí)拓展了拉曼顯微光譜在植物細(xì)胞壁研究中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

毛竹(Phyllostachyspubescens)莖長約25 m， 采自國際竹藤中心安徽太平試驗(yàn)中心林場。 從基部至稍部第10節(jié)節(jié)間截取竹筒， 竹筒沿軸向分割成2.0 cm×1.5 cm×10.0 cm的竹條， 進(jìn)一步利用單面刀片分割成長寬高0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的矩形樣品塊。 然后利用滑走式切片機(jī)(Leica RM 2010R)切取15 μm厚的樣品橫截面切片， 保存在超純水中供成像使用。

1.2 共聚焦顯微熒光成像

將樣品進(jìn)一步分割成0.2 cm×0.2 cm×1.0 cm火柴棒大小竹條放入體積比為1∶1的30%雙氧水和冰醋酸混合溶液中， 在80 ℃水浴鍋中解離2 h。 獲得的樣品用蒸餾水反復(fù)沖洗后置于表面皿中用0.001%的吖啶橙溶液染色15 min， 然后利用50%(1 min)， 100%(20 s, 兩次)梯度乙醇進(jìn)行脫水， 脫水后的切片置于載玻片上， 滴一滴甘油， 蓋上蓋玻片， 然后使用加拿大樹脂封片。 檢測時(shí)采用的共聚焦熒光顯微鏡為CarlZeiss LM510 Meta， 激發(fā)光源為488 nm Ar-Kr激光器， 發(fā)射波長為558 nm， 竹材橫切面切片的自發(fā)熒光成像采用相同的測試條件。

1.3 共聚焦顯微拉曼光譜成像

將15 μm厚的毛竹橫截面切片置于載玻片上， 滴一滴去離子水， 蓋上蓋玻片， 然后使用加拿大樹脂封片后采用顯微共聚焦拉曼光譜(LabRAMHR Evolution, Horiba JobinYvon)進(jìn)行光譜采集和成像。 為了獲得較高的空間分辨率， 光譜采集時(shí)采用100倍油鏡(Plan N 100×， Oil， NA=1.25)以及532 nm激發(fā)波長， 到達(dá)樣品的激光功率為8 mW。 測試用光柵300 mm-1， 狹縫寬度100 μm， 掃描步距0.5 μm， 單點(diǎn)光譜采集時(shí)間1 s， 光譜測定范圍3 100～500 cm-1， 光譜分辨率2 cm-1。 獲得數(shù)據(jù)利用LabSpec6軟件進(jìn)行線性偏最小二乘法基線校正， 然后利用特征峰峰高進(jìn)行成像分析。 偏振光拉曼成像時(shí)入射激光偏振方向平行于細(xì)胞徑向壁。

1.4 透射電子顯微鏡成像

將竹條分割成0.2 cm×0.2 cm×1.0 cm火柴棒大小， 無水乙醇脫水后， 采用Spurr低粘度樹脂對其進(jìn)行滲透包埋， 固化溫度為80 ℃(12 h)。 修整后的樣品塊， 通過Leica超微切片機(jī)(EM-UC6)獲取90 nm的超薄切片帶， 使用的鉆刀為Diatome-Ultra45°。 在室溫下用2%(w/v)高錳酸鉀溶液對超薄切片染色1 min， 蒸餾水反復(fù)沖洗三遍后， 自然晾干。 用JEM-1230透射電子顯微鏡， 在加速電壓為80 kV的條件下， 對竹材薄壁細(xì)胞分層結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 共聚焦顯微熒光成像研究

薄壁細(xì)胞是竹材基本組織中的主要細(xì)胞類型， 起到填充、 貯存及應(yīng)力緩沖作用， 是竹材構(gòu)成中的重要組成成分[12]。 通過竹材節(jié)間組織橫切面共聚焦熒光顯微圖像可以清楚的發(fā)現(xiàn)竹材由維管束及環(huán)繞其分布的基本薄壁組織組成。 維管束中的主要細(xì)胞類型有薄壁細(xì)胞、 纖維細(xì)胞以及導(dǎo)管等[圖1(a)]。 薄壁細(xì)胞通常細(xì)胞腔大， 壁薄， 橫截面近乎圓形， 具有明顯的細(xì)胞間隙[圖1(b)]， 其次生壁臨近細(xì)胞腔及復(fù)合胞間層臨近細(xì)胞角隅的部分呈現(xiàn)出較高的木質(zhì)化程度。 薄壁細(xì)胞可以分為長形細(xì)胞和短細(xì)胞兩種。 相比于長形細(xì)胞， 短細(xì)胞具有更薄的細(xì)胞壁， 散布于長形細(xì)胞之間[圖1(c)]。

圖1 毛竹維管束、 薄壁細(xì)胞橫切面及解離后的毛竹細(xì)胞熒光成像

2.2 多糖拉曼光譜歸屬

拉曼光譜中的特征峰是由樣品組份分子的非彈性散射產(chǎn)生的， 前人研究表明植物細(xì)胞壁中纖維素、 半纖維素和木質(zhì)素均能產(chǎn)生明顯的拉曼信號[13]。 比較竹材薄壁細(xì)胞， 細(xì)胞角隅(ccml)， 復(fù)合胞間層(cml)， 次生壁外層(s-out)以及次生壁內(nèi)層(s-in)拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)區(qū)域的拉曼特征鋒主要出現(xiàn)在2 897 cm-1(—CH, —CH2伸縮振動(dòng))波數(shù)區(qū)[14]， 1 600 cm-1(木質(zhì)素芳香環(huán)伸縮振動(dòng))， 1 098 cm-1(糖苷鍵C—O—C伸縮振動(dòng))， 1 247 cm-1(木聚糖)， 520 cm-1(纖維素C—O—C彎曲振動(dòng))， 380 cm-1(吡喃環(huán)C—C—C對稱彎曲振動(dòng))(圖2)。

圖2 薄壁細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域拉曼光譜比較

2.3 毛竹薄壁細(xì)胞拉曼光譜成像

2.3.1 細(xì)胞壁形態(tài)及微纖絲取向

通過對—CH特征峰區(qū)域2 800～3 000 cm-1進(jìn)行積分，從獲得的拉曼光譜成像圖中毛竹薄壁細(xì)胞各個(gè)形態(tài)區(qū)域清晰可見[圖3(a)]。 由于受到共聚焦拉曼顯微鏡的空間分辨率(0.5 μm)的限制， 其次生壁中的亞層結(jié)構(gòu)難于區(qū)分。 通過對—CH特征峰區(qū)域320～400 cm-1進(jìn)行積分， 可以觀察到纖維素在薄壁細(xì)胞中均一性的分布規(guī)[圖3(b)]。 同時(shí)利用透射電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)薄壁細(xì)胞呈多層結(jié)構(gòu)， 且薄層的厚度在0.2～0.3 μm范圍內(nèi)[圖3(c)]。

研究指出天然纖維素拉曼光譜中的三個(gè)主要特征峰位于380， 1 097和2 897 cm-1處， 分別歸屬于吡喃環(huán)C—C—C的對稱彎曲振動(dòng)、 糖苷鍵C—O—C的非對稱伸縮振動(dòng)、 以及CH和CH2的伸縮振動(dòng)。 其中糖苷鍵C—O—C特征峰(1 097 cm-1)以及CH， CH2特征峰(2 897 cm-1)的拉曼信號強(qiáng)度與入射激光的偏振方向存在明顯的相關(guān)性。 偏振光拉曼光譜1 083～1 100 cm-1積分成像發(fā)現(xiàn)薄壁細(xì)胞次生壁在徑向具有較高的拉曼信號強(qiáng)度[圖4(a)]， 歸因于細(xì)胞次生壁的糖苷鍵C—O—C非對稱伸縮振動(dòng)更趨近平行于入射激光偏振方向。 另外， 拉曼信號在同一細(xì)胞壁亞層中均一的強(qiáng)度分布表明微纖絲高度定向有序排列。 由于纖維素分子中CH和CH2伸縮振動(dòng)方向近乎垂直于糖苷鍵C—O—C非對稱伸縮振動(dòng)， 因此對2 840～2 930 cm-1區(qū)域進(jìn)行積分， 薄壁細(xì)胞弦向次生壁具有更高的拉曼信號強(qiáng)度[圖4(b)]， 此時(shí)弦向壁CH和CH2伸縮振動(dòng)更趨近平行于入射激光方向。 同樣地對竹材纖維素方向敏感特征鋒1 083～1 100 cm-1積分時(shí)可以清楚的區(qū)分出竹材纖維細(xì)胞寬窄交替的層狀結(jié)構(gòu)， 且窄層在激光偏振方向具有更高的拉曼信號強(qiáng)度[圖4(c)]。

圖3 薄壁細(xì)胞形態(tài)及纖維素分布拉曼光譜成像及透射電子顯微圖像

圖4 薄壁細(xì)胞(a： 1 083～1 100 cm-1， b： 2 840～2 930 cm-1)及纖維細(xì)胞(c： 1 083～1 100 cm-1)

通過引入拉曼特征鋒的比值(I1 095/I2 939)可半定量的闡明纖維素微纖絲在薄壁細(xì)胞壁中的取向規(guī)律。 從表1中可以看出380 cm-1(吡喃環(huán)C—C—C對稱彎曲振動(dòng))拉曼特征峰在細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域中沒有明顯的空間取向規(guī)律。 而糖苷鍵C—O—C特征峰(1 097 cm-1)以及CH和CH2特征峰(2 897 cm-1)的拉曼信號強(qiáng)度在薄壁和纖維細(xì)胞弦向及徑向具有明顯的規(guī)律性。 薄壁細(xì)胞中I1 095/I2 939的均值為0.79， 與纖維細(xì)胞次生壁窄層的比值近似， 且明顯高于纖維細(xì)胞次生壁寬層(0.55～0.63)， 這表明這些區(qū)域中纖維素微纖絲更加趨近平行于入射激光電矢量偏振方向， 由于入射激光電矢量偏振方向與細(xì)胞軸向垂直， 由此可知相比于竹材纖維細(xì)胞寬層， 薄壁細(xì)胞與纖維細(xì)胞窄層中纖維素微纖絲的取向更加趨近垂直于細(xì)胞軸向， 也即更大的微纖絲角。

2.3.2 木質(zhì)素微區(qū)分布

表1 纖維素方向拉曼敏感特征峰比值表

圖5 薄壁細(xì)胞芳香化合物拉曼光譜成像

3 結(jié) 論

竹材薄壁細(xì)胞主要存在長型及短型兩種細(xì)胞形態(tài)， 其細(xì)胞壁中木質(zhì)素主要聚集于復(fù)合胞間層及次生壁內(nèi)層， 與木質(zhì)素共軛相聯(lián)的松柏醛/芥子醛， 以及以酯鍵和醚鍵與木質(zhì)素和半纖維素相聯(lián)的對羥基肉桂酸也呈現(xiàn)類似的分布規(guī)律。 纖維素分子在薄壁次生壁中呈均一性的分布規(guī)律， 在薄壁和纖維細(xì)胞次生壁中具有明顯的空間取向性。 由于受空間分辨率的限制， 薄壁細(xì)胞壁的分層結(jié)構(gòu)難以通過拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行成像， 納米紅外光譜成像技術(shù)因其更高的空間分辨率有望揭示纖維素分子在薄壁細(xì)胞次生壁亞層中的排列規(guī)律。