基于拉曼光譜快速檢測(cè)亞氯酸鈉法脫木素的動(dòng)力學(xué)及選擇性

金克霞， 江澤慧， 馬建鋒， 田根林， 楊淑敏， 尚莉莉， 馮 龍， 劉杏娥

國(guó)際竹藤中心， 竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100102

引 言

酸性亞氯酸鈉法是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的木質(zhì)素脫除方法， 在脫木質(zhì)素過(guò)程中可最大程度地保留綜纖維素不被脫除[1]。 研究表明木質(zhì)素脫除是一個(gè)極其復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程， 不僅受到細(xì)胞壁中木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體聯(lián)結(jié)類型的影響， 而且木質(zhì)素大分子間不同化學(xué)鍵合類型， 對(duì)試劑的反應(yīng)程度也不一樣[2-4]。 因此， 不同的木質(zhì)纖維素原料脫木素的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)也存在著差異[5]。 然而， 學(xué)者們?cè)谟脕喡人徕c法脫木素時(shí)， 其處理時(shí)間常常以經(jīng)驗(yàn)性為主， 常用的表征殘余木質(zhì)素含量的方法， 如離子色譜、 紅外光譜、 核磁共振等， 不僅制樣繁瑣、 耗時(shí)， 且反映的信息是植物細(xì)胞壁的總體平均結(jié)果， 關(guān)于脫木質(zhì)素過(guò)程中木質(zhì)素含量在不同細(xì)胞及形態(tài)學(xué)區(qū)域的動(dòng)態(tài)變化方面的有效信息相對(duì)較少。

拉曼光譜及顯微成像具有快速、 簡(jiǎn)單、 無(wú)損、 可重復(fù)檢測(cè)的特點(diǎn)， 同時(shí)具有較高的空間和光譜分辨率， 已廣泛應(yīng)用于分子化學(xué)結(jié)構(gòu)研究和化學(xué)組成分析[6]。 此外， 木質(zhì)素三種基本結(jié)構(gòu)單元， 即愈瘡木基(G)、 紫丁香基(S)和對(duì)羥苯基在拉曼光譜中均有特定的特征峰[7]。 因此， 本文擬采用拉曼光譜及顯微成像技術(shù)， 以闊葉木(桉木)、 針葉木(杉木)、 禾本科(毛竹)中最常見(jiàn)的樹(shù)種為例， 定性和半定量地測(cè)定亞氯酸鈉法脫木素過(guò)程中殘余木質(zhì)素及單體含量在不同細(xì)胞及形態(tài)學(xué)區(qū)域的動(dòng)態(tài)變化， 以加深對(duì)亞氯酸鈉法脫木素的動(dòng)力學(xué)及選擇性的理解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

桉木(Eucalyptusurophylla)， 高15.6 m， 直徑16.5 cm， 采自北京林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)； 杉木(Cunninghamialanceolate(Lamb.) Hook．)， 高8.4 m， 直徑11.3 cm， 采自浙江省麗水市白云山森林保護(hù)區(qū)； 毛竹(Phyllostachyspubescens)， 三年生， 采自國(guó)際竹藤中心安徽黃山太平實(shí)驗(yàn)中心林場(chǎng)。 三種木材均取胸徑材， 然后利用單面刀片將樣品分割成長(zhǎng)×寬×高大小為0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm左右的矩形樣品塊， 并用滑走式切片機(jī)(Leica RM 2010R)在橫截面切取15 μm厚的切片。

1.2 酸性亞氯酸鈉處理

將每組切片浸漬在酸性亞氯酸鹽溶液中， 密封， 并置于75 ℃的水浴鍋中， 處理時(shí)間根據(jù)不同切片中木質(zhì)素的實(shí)際脫除情況決定(0～1.5 h)。 酸性亞氯酸鈉鹽溶液的具體配制為： 固液比為1∶26， 亞氯酸鈉和冰醋酸的濃度分別0.3 g·g-1， 0.1 mL·g-1。 反應(yīng)結(jié)束后， 加入大量去離子水終止反應(yīng)， 小心取出切片， 并用去離子水反復(fù)沖洗至中性， 獲得的樣品用于拉曼顯微鏡檢測(cè)。

1.3 共聚焦拉曼顯微光譜檢測(cè)

每組亞氯酸鹽處理后的切片依次置于載玻片上， 封好片后采用顯微共聚焦拉曼光譜(HR Evolution, Horiba Jobin Yvon)進(jìn)行光譜采集和成像。 為獲得較高的空間分辨率， 光譜采集時(shí)采用100倍油鏡(MPlan100×， Oil， NA=1.25)以及532 nm激發(fā)波長(zhǎng)， 激光功率為8 mW。 測(cè)試時(shí)光柵為300 mm-1， 狹縫寬度為100 μm， 掃描步距0.5 μm， 單點(diǎn)光譜采集時(shí)間1 s， 光譜測(cè)定范圍500～3 100 cm-1， 光譜分辨率2 cm-1， 最后利用LabSpec6軟件對(duì)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行后期處理， 包括宇宙射線移除和光譜基線校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素的拉曼特征峰

圖1為未處理的桉木、 杉木、 毛竹纖維細(xì)胞次生壁的平均拉曼光譜， 不同樹(shù)種在1 270， 1 331和1 598 cm-1位置均有特征峰。 其中， 1 598 cm-1歸屬于木質(zhì)素芳香族骨架振動(dòng)， 1 270 cm-1歸屬于G型木質(zhì)素芳香環(huán)醚鍵伸縮振動(dòng)， 1 331 cm-1為S型木質(zhì)素酚羥基彎曲振動(dòng)[7]。 特別的， 不同于木材， 禾本科毛竹纖維細(xì)胞在1 171 cm-1處有獨(dú)特的拉曼特征峰， 歸屬于羥基肉桂酸(HCA)中肉桂酰酯鍵， 與木質(zhì)素和半纖維素以酯鍵和醚鍵連接， 進(jìn)而形成木質(zhì)素-酚酸-碳水化合物復(fù)合體存在于禾本科植物細(xì)胞壁中[8]。

2.2 亞氯酸鈉法脫木素的選擇性

通過(guò)對(duì)木質(zhì)素特征峰(1 540～1 700 cm-1)區(qū)域進(jìn)行積分， 發(fā)現(xiàn)在未處理桉木中， 導(dǎo)管次生壁(V-S)、 木射線次生壁(R-S)及纖維細(xì)胞的細(xì)胞角隅(CC)和復(fù)合胞間層(CML)均含有較高含量的木質(zhì)素， 而纖維細(xì)胞次生壁(F-S)中木質(zhì)素含量相對(duì)較低[圖2(a)]。 經(jīng)亞氯酸鈉溶液處理0.5 h后， 木質(zhì)素含量在各細(xì)胞類型中均顯著下降， 尤其是纖維細(xì)胞的CC和CML區(qū)域； 值得注意的是， V-S和R-S中木質(zhì)素含量依然要高于F-S。 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)(1.0～1.5 h)， 木質(zhì)素含量的分布變得更均勻， 各細(xì)胞濃度均變得很低。 在逐步脫除木質(zhì)素過(guò)程中， V-S和R-S展現(xiàn)出更高的殘留木質(zhì)素濃度[圖2(b—d)]， 其中V-S木質(zhì)素強(qiáng)度最高， R-S強(qiáng)度次之， F-S最低， 說(shuō)明導(dǎo)管細(xì)胞中木質(zhì)素最難被降解， 而纖維細(xì)胞中木質(zhì)素最容易被移除。 類似的， 針葉材杉木在逐步脫木質(zhì)素過(guò)程中， 射線細(xì)胞剩余木質(zhì)素的濃度也略高于纖維細(xì)胞(即管胞)， 進(jìn)一步證明在組織水平上纖維細(xì)胞中木質(zhì)素是最容易被降解的[圖2(e—h)]。

圖1 桉木、 杉木、 毛竹纖維細(xì)胞的平均拉曼光譜

為了進(jìn)一步探索脫木質(zhì)素過(guò)程中殘余木質(zhì)素濃度的動(dòng)態(tài)變化， 我們分別提取出不同樹(shù)種、 不同細(xì)胞中木質(zhì)素在1 598， 1 270(G型)和1 331 cm-1(S型)位置的平均拉曼光譜強(qiáng)度變化(圖3， 圖4)。 在脫木素過(guò)程中， 發(fā)現(xiàn)S型木質(zhì)素的拉曼強(qiáng)度降低比G型木質(zhì)素更顯著， 說(shuō)明S型木質(zhì)素在酸性亞氯酸鈉溶液中更容易被脫除。 類似的， 在酸處理和堿處理中， 也發(fā)現(xiàn)S型木質(zhì)素更容易被脫除[2, 9]。 這主要是因?yàn)镾型木質(zhì)素含有大量的β-β鍵， 其分子量更低， 有利于促進(jìn)木質(zhì)素在細(xì)胞壁間的移動(dòng)和脫除[10]。 此外， S型木質(zhì)素與碳水化合物間的交聯(lián)比G型木質(zhì)素少， 結(jié)構(gòu)更松散， 在木質(zhì)素溶解過(guò)程中其物理屏障更小[11]。

在未處理木材中， V-S和R-S中在1 270 cm-1處拉曼強(qiáng)度明顯高于F-S[圖3(b)和(e)]， 說(shuō)明V-S和R-S含有更高含量的G型木質(zhì)素。 就木質(zhì)化程度而言， 導(dǎo)管、 射線的木質(zhì)化程度也高于纖維細(xì)胞(V-S和R-S在1 598 cm-1處拉曼強(qiáng)度高于F-S)， 且在逐步脫木素的過(guò)程中三者相對(duì)木質(zhì)素濃度關(guān)系也基本保持不變， 這可能與細(xì)胞功能有關(guān)。 導(dǎo)管和射線細(xì)胞作為重要的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸通道， 在木材形成初期次生壁迅速加厚并木質(zhì)化， 且在整個(gè)木質(zhì)化階段都伴隨著G型木質(zhì)素的沉積[12]； 而纖維細(xì)胞作為木材主要的機(jī)械支撐， 化學(xué)成分以纖維素為主， 纖維細(xì)胞增厚較慢， 木質(zhì)化滯后， 木質(zhì)素的沉積主要以S型木質(zhì)素為主[13]。 因此， 高濃度的G型木質(zhì)素及延長(zhǎng)的木質(zhì)化過(guò)程使得導(dǎo)管和射線細(xì)胞比纖維細(xì)胞更難于脫除木質(zhì)素。

圖2 亞氯酸鈉脫木素過(guò)程中桉木(a—d)、 杉木(e—h)木質(zhì)素分布拉曼成像

圖3 亞氯酸鈉脫木素過(guò)程中桉木(a—c)、 杉木(d—f)、 毛竹(g—i)木質(zhì)素拉曼特征峰1 598 cm-1(a, d, g)、

在形態(tài)學(xué)區(qū)域， 木質(zhì)素的脫除也具有高度的選擇性。 在未處理的樣品中， 無(wú)論是桉木、 杉木， 還是毛竹中， CC的木質(zhì)素濃度均最高， CML次之， F-S最低。 然而， 經(jīng)亞氯酸鈉處理后， CC和CML區(qū)域木質(zhì)素迅速被脫除， F-S木質(zhì)素拉曼強(qiáng)度減少量最少(圖4)， CC木質(zhì)素濃度反而最低(圖3)， 說(shuō)明木質(zhì)素優(yōu)先從CC和CML區(qū)域脫除。 在細(xì)胞壁生物合成過(guò)程中， 木質(zhì)素與碳水化合物通過(guò)大量的化學(xué)鍵連接形成“鋼筋混泥土”結(jié)構(gòu)。 F-S含有大量的碳水化合物， 該區(qū)域的木質(zhì)素與碳水化合物互相交聯(lián)形成復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 而在CC和CML區(qū)域， 碳水化合物含量極少， 尤其是CC區(qū)域幾乎不含碳水化合物， 主要以木質(zhì)素為主， 該區(qū)域木質(zhì)素與碳水化合物化學(xué)鍵連接較少， 因此在脫木素過(guò)程中受到的阻力更小， 木質(zhì)素更容易脫除。

圖4 亞氯酸鈉脫木素過(guò)程中桉木(a—c)、 杉木(d—f)、 毛竹(g—i)木質(zhì)素拉曼特征峰1 598 cm-1(a, d, g)、 1 270 cm-1(b, e, h)及1 331 cm-1(c, f, i)相對(duì)強(qiáng)度減少百分比

2.3 亞氯酸鈉法脫木素的動(dòng)力學(xué)

通過(guò)提取逐步脫木素過(guò)程中樣品的平均拉曼光譜強(qiáng)度變化， 我們發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素降解在前期最明顯， 尤其是前0.5 h內(nèi)， 各樣品、 各區(qū)域拉曼強(qiáng)度減少均達(dá)80%以上， 而處理后期(1.0～1.5 h)木質(zhì)素的降解程度要小得多， 大約在5%～15%。 類似的， Siqueira等[14]曾報(bào)道甘蔗渣中大量木質(zhì)素在反應(yīng)前期(2 h)迅速被脫除， 而后期移除13%的殘留木質(zhì)素需多花一倍的時(shí)間。 研究表明， 木質(zhì)素大分子間通過(guò)縮合型C—C鍵和非縮合型C—O鍵連接， 包括β-O-4， β-5， β-β， 5-5， 4-O-5等鍵型， 其中占據(jù)最大比例的β-O-4鍵比縮合結(jié)構(gòu)中β-5， 5-5等鍵更容易斷裂[2, 9]。 因此， 前期優(yōu)先大量脫除的木質(zhì)素可能主要以β-O-4鍵連接， 而后期較難移除的木質(zhì)素主要以縮合型木質(zhì)素為主。

盡管不同樹(shù)種、 不同細(xì)胞在脫木素過(guò)程中動(dòng)力學(xué)總體趨勢(shì)基本一致， 但G、 S型木質(zhì)素的降解在不同細(xì)胞間有著巨大區(qū)別。 通過(guò)提取G型(1 270 cm-1)、 S型(1 331 cm-1)木質(zhì)素的拉曼光譜變化， 發(fā)現(xiàn)在前0.5 h內(nèi)， G型木質(zhì)素拉曼強(qiáng)度在桉木的V-S， R-S和F-S中減少量分別為62.33%， 74.27%和62.82%[圖4(b)]， 而在對(duì)應(yīng)區(qū)域S型木質(zhì)素拉曼強(qiáng)度減少程度分別為68.85%， 71.28%和70.19%[圖4(c)]， 除R-S外其他區(qū)域S型木質(zhì)素拉曼強(qiáng)度均比G型木質(zhì)素降低程度更高； 在杉木[圖4(e—f)]、 毛竹[圖4(h—i)]中， S型木質(zhì)素的減少也比G型木質(zhì)素約高5%～10%， 進(jìn)一步證明S型木質(zhì)素比G型木質(zhì)素更容易脫除。 在桉木R-S中， G型木質(zhì)素的脫除明顯高于V-S和F-S， 甚至高于S型木質(zhì)素單體； 在杉木中， 無(wú)論哪種木質(zhì)素單體， 射線細(xì)胞木質(zhì)素拉曼強(qiáng)度的降低程度也均高于管胞。 射線細(xì)胞的脫除規(guī)律較為特殊， 這可能與細(xì)胞類型有關(guān)： 射線細(xì)胞屬于薄壁細(xì)胞， 導(dǎo)管和纖維細(xì)胞(闊葉材)或管胞(針葉材)屬于厚壁細(xì)胞， 亞氯酸鈉溶液滲入薄壁的射線細(xì)胞比進(jìn)入厚壁細(xì)胞更容易， 因而木質(zhì)素的減少更明顯。

針、 闊葉材及禾本科的脫木素規(guī)律基本相似， 但我們發(fā)現(xiàn)相同厚度切片的毛竹脫木素所需時(shí)間要明顯少于木材。 如圖3(g)所示， 毛竹脫木素處理0.5 h后其特征峰1 598 cm-1處拉曼強(qiáng)度變化基本趨于平穩(wěn)。 因此我們縮短檢測(cè)周期， 每隔10 min檢測(cè)一次， 發(fā)現(xiàn)毛竹在前10 min內(nèi)1 598 cm-1處拉曼強(qiáng)度在F-S， CML和CC處就分別減少88.65%， 92.93%和91.29%， 而后期(20～60 min)拉曼強(qiáng)度減少只有7%～14%。 相比于木材， 竹材脫木素時(shí)間顯著縮短， 這可能與竹材中含有大量的HCA有關(guān)。 HCA與半纖維素和木質(zhì)素通過(guò)酯鍵和醚鍵相連接， 在酸性亞氯酸鈉溶液中， 竹材中HCA與木質(zhì)素之間的酯鍵比木材中木質(zhì)素與半纖維素之間的醚鍵更容易裂解[15]， 因此大大縮短了脫木素處理時(shí)間。

3 結(jié) 論

不同樹(shù)種、 不同細(xì)胞、 不同木質(zhì)素單元脫除動(dòng)力學(xué)均有差異， 利用拉曼光譜可以簡(jiǎn)單、 快速的獲得不同樹(shù)種、 組織、 細(xì)胞、 木質(zhì)素單元在脫木素過(guò)程中殘余木質(zhì)素含量的動(dòng)態(tài)變化。 在酸性亞氯酸鈉法脫木素過(guò)程中， 大量木質(zhì)素在前期迅速被脫除， 后期木質(zhì)素的移除效率下降。 并且， 亞氯酸鈉法脫木素具有高度的選擇性： 在組織水平， 導(dǎo)管中木質(zhì)素最難移除， 射線細(xì)胞次之， 纖維細(xì)胞最容易； 在形態(tài)學(xué)區(qū)域， 木質(zhì)素移除率CC最高， 其次是CML， F-S最低； 對(duì)于木質(zhì)素單元而言， S型木質(zhì)素比G型木質(zhì)素降解更容易。